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研究背景与目的:近年来世界范围内糖尿病,包括儿童1型糖尿病和2型糖尿病,发病率均逐年上升。糖尿病,特别是儿童1型糖尿病,首选治疗方案为胰岛素替代治疗,但因各种原因,胰岛素替代治疗效果欠佳,从而糖尿病引起的慢性并发症及合并症,如糖尿病肾病、糖尿病神经病变,糖尿病血管病变等,不止严重影响儿童青少年的身体健康,也使糖尿病逐渐成为世界范围内人类死亡的主要原因之一。目前且已有研究发现Notch信号在胰腺的发育分化中起着重要作用,而自噬能通过调节β细胞功能等而影响糖尿病进展。此外,体外定向诱导分化胰腺上皮细胞用于β细胞移植是治疗糖尿病的趋势之一。本研究旨在通过探寻Notch信号及自噬在体外定向诱导分化胰腺上皮细胞中的作用机制,以期为探寻糖尿病治疗的新策略打下一定的基础。研究方法:1.构建过表达Hesl增强或应用DAPT抑制胰腺导管上皮细胞的Notch信号,以RT-PCR、Western blot检测其对Notch信号相关Hesl,胰腺转录因子Pdxl、Rfx6,及细胞周期抑制因子p21、p27等表达的影响,同时以RT-PCR、免疫荧光、细胞流式及ELISA检测insulin、ghrelin表达分布及水平的影响,来探讨Notch信号对PDEC胰岛素表达阳性细胞增殖等的影响。2.通过饥饿诱导或应用3-MA抑制胰腺导管上皮细胞自噬,以免疫荧光及Western blot检测其对自噬相关因子LC3、Beclinl,Notch信号相关Hesl,及细胞周期抑制因子p21、p27等表达的影响,同时以ELISA及细胞流式检测其对insulin、ghrelin水平及表达的影响,来探讨自噬介导的Notch信号对PDEC胰岛素阳性表达细胞增殖等影响。研究结果:1.与对照组相比,流式细胞术发现Hesl过表达组PDEC细胞insulin 阳性表达细胞比率及ghrelin 阳性表达细胞比率明显下降(p<0.01),DAPT处理组PDEC细胞insulin 阳性表达细胞比率及ghrelin 阳性表达细胞比率明显上升(p<0.01)。RT-PCR 及 western blot 结果显示,Hesl 过表达组 PDEC 细胞 Pdxl、Rfx6、P27、p21表达下调,DAPT处理组PDEC细胞Pdxl、Rfx6、P27、p21表达上调。RT-PCR、免疫荧光及细胞上清液ELISA检测显示,Hesl过表达组PDEC细胞insulin及Ghrelin表达、分布及分泌减少,而DAPT处理组PDEC细胞insulin及Ghrelin表达、分布及分泌增多。2.与对照组比较,免疫荧光及western blot检测显示饥饿组PDEC细胞Beclinl及LC3-II表达增多,3-MA处理组PDEC细胞Beclinl及LC3-Ⅱ表达减少。Western blot检测显示饥饿组PDEC细胞Hesl表达减少(p<0.01),而p21、p27表达增加(p<0.01),而3-MA处理组PDEC细胞结果相反(p<0.01)。细胞流式及细胞上清液ELISA检测提示,饥饿组PDEC细胞insulin及ghrelin 阳性表达率及分泌增多(p<0.01),而3-MA处理组结果相反(p<0.01)。结论:自噬可以负向调节Notch信号,而Notch信号抑制可能通过上调胰腺转录因子水平,从而导致产胰岛素细胞表达增多,并增加胰岛素等的分泌。结合自噬介导的Notch信号对胰腺导管上皮细胞的作用,未来可能通过Notch信号及自噬介导促进胰腺导管上皮细胞定向分化成为β细胞,从而为β细胞移植治疗糖尿病提供一定的基础。