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肝素是糖醛酸和葡萄糖胺残基通过1→4糖苷键连接的,高度硫酸化的线性粘多糖,广泛存在于动物肝脏、肺脏,小肠粘膜等组织细胞中。肝素具有良好的抗凝血作用,目前被普遍用于手术治疗过程和抗静脉血栓形成等临床实践中。我国是肝素的最大出口国,然而多是低效价的粗品肝素,研究肝素的精制方法和工艺对开发高品质肝素药物具有重要意义。近年研究表明,肝素及其寡糖除抗凝血作用外,还具有抗炎和治疗肿瘤等其他生理活性,研究肝素及其寡糖的结构是揭示其功能的重要前提。本研究以猪小肠粘膜为原料,提取肝素,并加以比较各种精制方法；通过亚硝酸降解来研究和分析肝素的可控降解方法,为进一步研究肝素多糖的序列结构和肝素寡糖结构和功能的关系奠定基础。得出以下结论：1.从猪小肠中提取并精制后肝素的理化性质：高效凝胶排阻层析法测得其分子量在23000Da左右；PMP柱前衍生化液相色谱分析法表明肝素由GlcUA、GlcN和IdoUA三种单糖组成；苯酚-硫酸法测得其总糖含量为63.2%；Bradford法测得蛋白含量为0.5%,明胶-氯化钡法测定硫酸基含量为31.0%,精制后效价在160U以上。2.本研究比较了用于肝素精制的多种方法,如酸碱氧化法,离子交换法,凝胶排阻法,p-消除结合离子交换法及p-消除结合凝胶排阻法,结果表明β-消除结合离子交换法所精制的样品效价和效价回收率较高,效价高达165U,效价回收率接近80%。3.建立了肝素单糖组成分析方法及肝素纯度的检测方法：采用柱前衍生化法,用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)对样品可能存在的标准单糖衍生后,进行HPLC分析。色谱条件：流动相为乙酸铵-乙腈体系(78：22),等度洗脱,流速为1.0mL·min-1,检测器为紫外检测器。在该色谱条件下,各单糖标准品和样品组分单糖衍生物均达到了基线分离。用该方法对肝素进行单糖组成分析,并与标准的单糖分离色谱进行比较,结果显示,该方法既能分析肝素的单糖组成,还可以检测肝素中可能混合的其他酸性糖,如多硫酸软骨素。4.建立了亚硝酸降解生成肝素寡糖及LC-ESI-MS的分析方法：采用50mmol/L的NaNO2在pH1.5条件下反应5min,得到肝素小分子寡糖,降解效果良好。经过AEC衍生化后,采用反相C18色谱柱,乙酸铵和乙腈分离体系。LC-ESI-MS液质联用分离分析条件：流动相A:0.01mol/L乙酸铵水溶液(pH4.5),流动相B：乙腈；梯度洗脱程序：0-150min,80%A-40%A(体积分数)；流速：0.2ml/min;紫外检测波长：254nm；进样体积：10μL；柱温：25℃。硫酸化程度不同的寡糖得到了分离,实现了反相柱上分离分析肝素寡糖的目的,为肝素寡糖的质量控制和大规模制备提供检测手段。5.建立了肝素寡糖AEC标记的多级质谱(MSn)分析方法：通过对肝素寡糖主要离子峰进行多级质谱分析,可以推测出肝素是糖醛酸和氨基葡萄糖连接的主体结构,氨基葡萄糖上既有N硫酸化修饰,还存在3,6-位的O硫酸化修饰,还证实了其中糖醛酸也有硫酸化的修饰。肝素寡糖MSn分析为肝素寡糖结构和序列的分析奠定基础。