目的类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种以慢性关节炎症为特征的全身性自身免疫病(autoimmune disease,AD),尽管其发病与遗传、环境等多因素有关,但近年来的研究表明,免疫细胞功能的失衡,尤其是辅助性T细胞17(T helper cell 17,Th17)与调节性T细胞(regulatory T cells,Treg)之间的失衡己成为RA的发病原因之一,表现为Th17细胞的数目增多,功能增强,Treg细胞的功能减弱。在AD中,交感神经系统(sympathetic nervous system,SNS)主要通过肾上腺素β2受体(β2-adrenergic receptor,β2-AR)对免疫细胞的功能进行调节。β2-AR属于G蛋白偶联受体(G-protein coupledreceptors,GPCRs)超家族,有典型的GPCR的特征。当β2-AR被激活后,一方面可通过环磷酸腺苷(Cyclic Adenosine monophosphate,cAMP)以及下游的蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)信号通路产生效应,另一方面可被GPCRs 激酶(G-protein coupled receptor kinases,GRKs)磷酸化,促进阻抑素(β-arrestin)与受体的结合,造成受体的内吞和失敏。另外,β-arrestin2还可以通过激活其他信号分子如细胞外调节蛋白激酶 1/2(extracellular regulated protein kinases1/2,ERK1/2)等,产生不同的细胞功能。本实验室先前的研究表明,去甲肾上腺素(Norepinephrine,NE)可通过β2-AR信号通路显著抑制胶原诱导型关节炎(collagen-induced arthritis,CIA)小鼠Th17细胞的增殖和分化,然而β2-AR信号是如何调节CIA的Treg细胞功能的则尚不清楚。为此,在本研究中,我们首先观察了 β2-AR的激活对CIA小鼠Treg细胞功能的影响,并通过探讨其信号通路了解其机制,接着通过给CIA小鼠输入功能增强的Treg细胞,观察对CIA小鼠关节炎症,骨破坏以及Th17/Treg失衡的影响。希望通过我们的研究能更好地理解在CIA条件下β2-AR对免疫细胞功能的调节作用,继而能进一步为临床上RA靶向药物的开发开辟新的思路。方法1.CIA小鼠模型的制备:DBA1J小鼠,雄性,8-10周龄,用鸡Ⅱ型胶原(collagenⅡ,CⅡ)进行免疫,诱导关节炎的发生。观察小鼠临床表现的变化并进行临床评分,初次免疫后第41天检测后脚掌厚度和踝关节宽度、用HE染色法观察关节的组织病理学改变、ELISA法检测血清抗CII-IgG的抗体水平。2.CIA小鼠Treg细胞内β 2-AR激活后各信号分子的改变:2.1 CIA小鼠于初次免疫后第41天,无菌分离正常小鼠和CIA小鼠脾脏Treg细胞,实验分成6组:1、正常Treg细胞;2、正常Treg细胞+特布他林(terbutaline,Terb)(10-5M);3、正常 Treg 细胞+Terb(10-4M);4、CIA Treg 细胞;5、CIA Treg细胞+Terb(10-5M);6、CIA Treg 细胞+Terb(10-4M)。Western-blot 法检测 β2-AR、PKA、β-arrestin2的表达及ERK1/2的磷酸化水平、ELISA法检测cAMP含量、PKA活性。2.2 为观察 β 2-AR-cAMP-PKA 与 β2-AR-β-arrestin2-ERK1/2 信号通路在对 CIA 的Treg细胞是否存在交叉作用,同样于初次免疫后第41天,无菌分离正常小鼠和CIA小鼠脾脏Treg细胞,实验分组为:1、正常Treg细胞;2、CIA Treg细胞;3、CIA Treg细胞+Terb(10-4M);4、CIA Treg细胞+H-89(10-5M)+Terb(10-4M);5、CIA Treg细胞+β-arrestin2-shRNA+Terb 6、CIA Treg 细胞+U0126(10-6M)+Terb(10-4M)。ELISA 法检测 Treg 细胞 cAMP 含量,PKA 活性。Western-blot 法检测 Treg细胞 β-arrestin2、pERK1/2、ERK1/2 的表达水平。3.CIA小鼠Treg细胞内β 2-AR激活对Treg细胞功能的影响:3.1检测β 2-AR-cAMP-PKA通路的激活对CIA Treg细胞功能的影响,于CIA小鼠初次免疫后第41天,无菌分离正常小鼠和CIA小鼠脾脏Treg细胞,实验分成6组:1、正常Treg细胞;2、CIATreg细胞;3、CIATreg细胞+Terb(10-5M);4、CIA Treg细胞+Terb(10-4M);5、CIA Treg细胞+PKA抑制剂H-89(10-6M)+Terb(10-4M)6、CIA Treg 细胞+H-89(10-5M)+Terb(10-4M)。Real-time PCR 方法检测 IL-I0 mRNA及TGF-β的mRNA水平,ELISA方法测细胞培养上清中转化生长因子β(transforming growth factor β,TGF-β)、白细胞介素十(Interleukin,IL-10)的分泌。另外,为了检测Treg细胞抑制Teff细胞增殖的能力变化,初次免疫后第41天,无菌分离正常小鼠和CIA小鼠脾脏Treg细胞(CD4+CD25+),同时分离小鼠Teff(CD4+CD25-)细胞,抗CD3/CD28抗体刺激Teff细胞增殖,羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂(CFSE)染料对Teff细胞进行染色,分别培养48小时后以1:3的比例将Treg细胞与Teff细胞混合,继续培养48小时,流式细胞术检测Teff细胞的增殖变化情况。实验分组为:1、Teff细胞;2、正常Treg细胞+Teff细胞;3、正常Treg细胞+Terb(10-4M)+Teff细胞;4、CIATreg 细胞+Teff细胞;5、CIATreg 细胞+Terb(10-4M)+Teff 细胞;6、CIA Treg 细胞+H-89(10-5M)+Terb(10-4M)+Teff 细胞。3.2为检测β2-AR-β-arrestin2-ERK1/2通路的激活对CIATreg细胞功能的影响,我们首先构建了针对小鼠β-arrestin2基因的三对shRNA以及一对阴性shRNA,转染正常小鼠Treg细胞,筛选出一对沉默效率最高的shRNA,接着同样于初次免疫后第41天,无菌分离正常小鼠和CIA小鼠脾脏Treg细胞,实验分成6组:1、正常Treg细胞;2、CIA Treg 细胞;3、CIA Treg 细胞+Terb 4、CIA Treg 细胞+β-arrestin2-shRNA-mock+Terb(10-4M);5、CIA Treg细胞+β-arrestin2-shRNA+Terb(10-4bM);6、CIATreg 细胞+ERK 抑制剂 U0126(1μM)+Terb(10-4M)。Real-time PCR法检测IL-10、TGF-β的mRNA水平,ELISA法检测细胞培养上清中IL-10、TGF-β的分泌。另外,如上法分离和培养Treg细胞和Teff细胞,流式细胞术检测Teff细胞的增殖变化情况。实验分组为:1、Teff细胞;2、正常Treg细胞+Teff细胞;3、CIA Treg 细胞+Teff 细胞;4、CIA Treg 细胞+β-arrestin2-shRNA-mock+Terb(10-4M)+Teff细胞。5、CIA Treg细胞+β-arrestin2-sshRNA+Terb(10-4M)+Teff细胞6、CIA Treg细胞+U0126(10-6M)+Terb(10-4M)+Teff 细胞。3.3为检测β-arrestin2基因过表达对CIA Treg细胞功能的影响,我们首先构建了针对小鼠β-arrestin2基因的慢病毒以及阴性对照病毒,感染正常小鼠Treg细胞,westem-blot法检测β-arrestin2蛋白表达,检验β-arrestin2基因过表达情况。接着于初次免疫后第41天,无菌分离正常小鼠和CIA小鼠Treg细胞,慢病毒感染CIA Treg细胞,实验分组为:1、正常Treg细胞;2、CIA Treg细胞;3、CIA Treg细胞+Terb(10-4M);4、CIA Treg 细胞+β-arrestin2-negative lentiviral+Terb(10-4M);5、CIATreg细胞+β-arrestin2-lentiviral+Terb(10-4M)。实时 PCR 法测 IL-10 及 TGF-p 的 mRNA表达,用ELISA法检测细胞培养上清中IL-10、TGF-β的分泌。其次于初次免疫第41天,检测Treg细胞抑制Teff细胞增殖的能力变化,如上法分离和培养Treg细胞和Teff细胞,流式细胞术检测Teff细胞的增殖变化情况。实验分组为:1、Teff细胞;2、正常 Treg 细胞+Teff 细胞;3、CIATreg 细胞+Teff 细胞;4、CIATreg 细胞+Terb(10-4M)+Teff 细胞;5、CIA Treg 细胞+β-arrestin2 negative lentiviral+Terb(10-4M)+Teff 细胞;6、CIA Treg 细胞+β-arrestin2 lentiviral+Terb(10-4M)+Teff 细胞。4.给CIA小鼠输入β-arrestin2基因过表达的Treg细胞后,连续观察CIA疾病的进展情况:取正常小鼠脾脏,分选Treg细胞,分成两组:1、β-arrestin2过表达的Treg细胞;2、同样数目未处理的Treg细胞,于初次免疫后第40天,经尾静脉输入给CIA小鼠体内。实验分组:1、正常小鼠;2、CIA小鼠;3、CIA小鼠+未处理的Treg细胞;4、CIA小鼠+β-arrestin2基因过表达的Treg细胞,连续观察15天,记录小鼠四肢临床评分直至初次免疫后第55天;连续观察15天后,检测踝关节宽度和后脚掌厚度、HE染色观察踝关节组织病理学改变、ELISA法检测血清抗CII-IgG抗体水平;连续观察15天后,real-time PCR法检测踝关节IL-10、TGF-β、IL-17和IL-22的mRNA水平以及破骨细胞的基因组织蛋白酶K(cathepsin K,Ctsk)、抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase,TRAP)、降钙素受体(calcitonin receptor,Ctr)及基质金属蛋白酶(matrix metalloprotein,MMP)-9和成骨细胞的基因骨钙素(Osteocalcin)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、胶原蛋白 Ⅰ 型(CollagenⅠ,Col1)α1及胶原蛋白Ⅱ型(Col1α2)的mRNA表达变化,ELISA法检测关节组织上清和血清中IL-10、TGF-β、IL-17和IL-22的含量;连续观察15天后,流式细胞术检测脾脏CD4+T细胞中Th17和Treg细胞数目的百分比变化。结果1.CIA小鼠的关节炎症、关节病理损伤及血清抗体水平的改变:CIA小鼠从初次免疫第31天四肢临床评分开始增高,而初次免疫后第35天到达顶峰,后脚掌厚度和踝关节宽度均增加,血清中抗Ⅱ型胶原免疫球蛋白G(CⅡ-IgG)的抗体水平升高。苏木精—伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色显示CIA小鼠踝关节腔隙变窄、滑膜组织增生、炎症细胞浸润。2.CIA增强Treg细胞内β2-AR-cAMP-PKA信号,β2-AR激动剂进一步促进该信号通路的激活:CIA Treg细胞β2-AR表达上调,Terb使正常与CIA的Treg细胞表达β2-AR进一步上调,而CIA条件下,β2-AR上调的幅度变小。另外,CIA Treg细胞内cAMP-PKA信号通路激活,Terb进一步激活了该信号通路:CIA Treg细胞中cAMP含量增加,PKA活性增强,表达上调。Terb能进一步增加Treg细胞cAMP的含量,进一步增强PKA活性,进一步上调PKA的表达。然而,CIA情况下,cAMP-PKA信号通路激活的幅度下降。3.Treg细胞内β2-AR的激活增强了 CIA的Treg细胞功能,该作用被PKA抑制剂部分阻断:CIA Treg细胞产生IL-10和TGF-β增加,Terb显著上调CIA Treg细胞IL-10和TGF-β的产生,PKA抑制剂H-89能部分阻断Terb的作用。另外,CIA组Treg细胞抑制Teff细胞增殖的能力下降,Terb可增强CIATreg细胞抑制Teff细胞增殖的能力,而Terb的这个作用可被H-89部分拮抗。4.CIA增强Treg细胞内β-arrestin2-ERK1/2信号通路,β2-AR激动剂进一步促进该信号通路的激活:CIA Treg细胞β-arrestin2的表达及pERK1/2的水平增高。Terb能进一步上调正常及CIATreg细胞的β-arrestin2的表达及pERK1/2的水平。另外,CIA情况下,β-arrestin2-ERK1/2信号通路激活的幅度下降。5.Treg细胞内β2-AR的激活增强了 Treg细胞功能,该作用可被β-arrestin2基因沉默或ERK1/2抑制剂所部分阻断:CIA Treg细胞TGF-β及IL-10的产生升高。Terb进一步升高TGF-β及IL-10的产生。β-arrestin2基因干扰和ERK抑制后显著下调Terb激活β2-AR后的TGF-β及IL-10的产生水平。另外,CIA小鼠Treg细胞抑制Teff细胞增殖的功能减弱;Terb可增强CIA Treg细胞抑制Teff细胞增殖的功能,β-arrestin2基因干扰和ERK1/2抑制后明显减弱Terb增强的Treg细胞对Teff的抑制作用。6.β2-AR激动剂促进了 CIA的Treg细胞内两条信号通路cAMP-PKA和β-arrestin2-ERK1/2的激活,且这两条信号通路之间具有交互作用:β2-AR激活后,β-arrestin2基因干扰能进一步增加CIA Treg细胞cAMP水平;进一步增强CIA Treg细胞的PKA的活性水平;另外,β2-AR激活后,H-89显著上调了 CIA Treg细胞β-arrestin2的蛋白表达,以及pERK1/2的水平。7.CIA的Treg细胞内β-arrestin2基因过表达进一步促进了 β2-AR激动剂诱导的Treg细胞功能增强:CIATreg细胞IL-10与TGF-β的产生均增高,Terb显著上调了这两种细胞因子的产生。β-arrestin2基因过表达能进一步上调CIATreg细胞IL-10及TGF-β的产生并且显著增强CIATreg细胞对Teff细胞增殖的抑制功能。8.给CIA小鼠输入Treg细胞后,CIA的关节炎症、骨破坏、血清抗体水平升高、Th17/Treg失衡均有所减轻,给CIA小鼠输入β-arrestin2基因过表达的Treg细胞后则进一步减轻了上述症状:CIA小鼠输入Treg细胞后,关节红肿明显减轻、临床评分降低、关节腔炎性细胞浸润减少,而输入β-arrestin基因过表达的Treg细胞后,关节红肿进一步减轻、临床评分进一步降低;CIA小鼠输入Treg细胞后,关节中破骨细胞特异性基因的表达降低,成骨细胞特异性基因的表达增加,关节中IL-10和TGF-β的mRNA水平增高,关节组织上清中TGF-β的含量增高,IL-17的含量降低,输入β-arrestin基因过表达的Treg细胞后,破骨细胞特异性基因的mRNA水平进一步降低,成骨细胞特异性基因mRNA水平进一步增加;关节中IL-10和TGF-βmRNA水平进一步上升;关节组织上清中TGF-β的含量进一步上升,IL-10含量上升,IL-22含量降低;CIA小鼠输入Treg细胞后,血清中抗CⅡ型胶原抗体的水平降低,TGF-β和IL-10的浓度增高,IL-17的浓度降低,而输入β-arrestin基因过表达的Treg细胞后IL-17的浓度进一步降低;CIA小鼠输入Treg细胞后,脾脏CD4+T细胞中Treg细胞(CD25+FOXP3+)数目增多,输入β-arrestin基因过表达的Treg细胞后脾脏CD4+T细胞中Treg细胞(CD25+FOXP3+)数目进一步增多。结论1.RA 模型小鼠 Treg 细胞 β2-AR-cAMP-PKA 信号通路及β2-AR-β-arrestin2-ERK1/2信号通路激活,β2-AR激动剂可进一步激活这两条通路。2.β2-AR激活后,RA模型小鼠Treg细胞功能增强,该作用不仅由经典的β2-AR-cAMP-PKA信号通路参与介导,并且也由β2-AR-β-arrestin2-ERK1/2信号通路参与介导,且这两条通路之间存在着交叉作用。3.β-arrestin2基因过表达增强RA模型小鼠Treg细胞功能,输入β-arrestin2基因过表达的Treg细胞可抑制Th17/Treg失衡、减轻关节炎症及骨损伤。