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前言 沿窦状隙发生的周围型纤维化是酒精性肝纤维化的病理特征之一，目前认为与多种细胞和细胞因子有关。参与的细胞如肝细胞、星状细胞(hepatic stellate cells，HSC)、库否细胞(Kupffer cell，KC)、肝窦内皮细胞(Liver Sinusoids Endothelial Cell，LSEC)和肌成纤维细胞等，细胞因子如表皮生长因子(epithelial growth factor，EGF)、白介素(interleucin，IL)-2和IL-10、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)和血小板衍生生长因子(platelet derived growth factor，PDGF)等。 LSEC是特殊化的毛细血管内皮细胞，具有无隔膜的窗孔(fenestrae)且无基底膜(basement membrane，BM)。它是肝脏的第一道屏障，门脉系统带来的、肠道吸收的包括乙醇在内的各种物质(包括有毒或有害的物质)首先作用于LSEC。长期持续的作用可使其表面的窗孔数逐渐减少或消失(失窗孔化)，内皮下BM逐渐形成，并发展为肝窦毛细血管化(sinusoid capillarization)，这是肝纤维化早期的最基本特征。 慢性乙醇滥用可导致酒精性脂肪肝、脂肪坏死(肝炎)、肝纤维化和肝硬化，这些病理改变与LSEC的关系目前所知甚少。一些研究认为短期少量摄入乙醇，可扩张窗孔，增加脂质的代谢；慢性乙醇滥用可导致LSEC窗孔数量的减少、孔隙率下降，引起乙醇中毒相关的高脂蛋白血症和动脉粥样硬化形成等，可见乙醇对LSEC结构和功能有重要的影响。 影响LSEC的因素中乙醇的量、时间在不同的研究者中有不同的定义，不同的研究对象(人、鼠、兔子等)LSEC的结构也不尽相同，而且均缺乏连续的动态观察。 我们在既往的动物实验研究中，不仅成功地建立了大鼠酒精性肝纤维化的动物模型，还比较系统地动态研究了乙醇致大鼠肝纤维化过程中肝脏组织的病理学改变、多种细胞因子的变化、HSC的影响、细胞外基质形成和降解相关因素的变化等。同时动物实验也观察到，中药抗纤复方Ⅰ号(KangXian Fu Fang I，KXI)可明显抑制乙醛促进的HSC分泌、(matrix metalloproteinase，MMP)-2和-9的表达，以及转化生长因子(transforming growth fac-tor，TGF)一Letal和血小板衍生生长因子(platelet derived脚wth faetor，PDGF)的分泌，影响胶原的形成等，从而达到预防和治疗酒精性肝病。 本研究将在既往研究的基础上，进一步动态观察慢性乙醇摄人对大鼠在体和离体15EC形态和结构的改变，同时应用KXI进行动态干预，探讨乙醇慢性摄人对巧EC形态和结构的影响和KXI预防酒精性肝病的理论依据。材料与方法 1.实验材料与仪器 1.1实验动物 wister系雄性大鼠(2009士109)，由中国医科大学实验动物部提供。 1.2实验试剂 热灭活的小牛血清(FCS一HI，购自Hycolon公司)、胶原酶A和胶原一S(购自Roehe公司)、DN’asel(购自华美公司)、RPMI一2640(购自Gibeo公司)、内皮细胞生长因子(购自Roche公司)。 KXI号(主要有丹参、黄茂、红花、汉方己、葛根、桃仁、甘草等药物组成)，由我院制剂室制成浓缩口服制剂，含生药2.7群耐。 1.3实验仪器 Beckman低温(恒温)离心机、飞利浦EM400电子显微镜(扫描)、JEM一1200EX透射电镜(TEM)、荧光显微镜(328nm的激射光)、奥林帕斯显微镜等。 2.动物模型建立的方法 2.1酒精性肝病实验动物模型的建立(乙醇灌胃的方法) 参考本研究室已经建立的方法(见参考文献13)。 2.2 Kxl中药预防组动物模型的建立 参考本研究室已经建立的方法(见参考文献40)。 3.此Ec的分离、提纯与培养 3.1巧EC的分离、提纯 应用Pertoft方法稍加改良进行LSEC的分离，即胶原酶对大鼠肝脏进行原位灌流消化，用Percoll分离液(上层为25%Percoll20耐、下层为50%Percoll巧耐)梯度离心，小心移取位于2个密度层之间的细胞带(富含LSEC细胞层)进行纯化，最后的沉淀物加人培养液并使其浓度为1 .sx100/耐个细胞。 3.2璐EC的培养 将细胞悬液用吸管移人24孔板中，每孔1耐。将24孔板放于37℃、含5%COZ、95%潮湿空气的孵育箱中培养20而n，以保证KC的选择性豁附。吸取孔中的巧EC，并于1血接种于胶原覆盖的盖薄片上(巧EC的浓度为0.8 x 106/而)，接种Zh后更换培养液，之后每24h更换一次。 3.3细胞的存活与鉴定 将细胞悬液加人0.4%胎盘蓝溶液中，混匀后光镜下未着色者为存活细胞。在选择性吸附之前，以HSC来检查UEC的纯化度，通过荧光显微镜来检测HSC(用328nm的激射光)，应用免疫染色的方法测定HSC的百分比。 4.电镜技术 大鼠腹腔麻醉后，经心脏灌流固定，从肝右叶中部取肝组织，用25mg·L一’戊二醛溶液固定，制备组织电镜标本。 取分离纯化的璐EC放人巧mg·L一‘戊二醛(含有0.巧M二甲基砷酸钠)内固定呈悬浮状态，在微型离心机中离心。其沉淀物在1%四氧化饿中进一步固定，脱水、环氧树脂包埋，用钻石刀切成60nm薄片。先用醋酸双氧铀染色，再用柠檬酸盐染色，在电子显微镜(80kV电压)下观察并进行有核细胞计数。对于培养的细胞，固定培养基、脱水、树脂包埋，