背景据统计,不孕不育在全球的发生率约为15%,已成为重要健康问题,严重威胁着人类后代繁衍和生活质量。引起人类生育力降低的原因众多,其中男性因素引起的不育约占所有不育人群的25%~30%。男性不育的病因复杂多样,目前尚未阐释清楚。肥胖作为机体代谢紊乱的一种宏观表现,通常在体内存在长期慢性炎症状态,内分泌紊乱等一系列的异常,是引起男性生育力受损的重要原因之一。尽管肥胖引发的男性生育力受损的研究众多,但目前其发生机制仍不清楚,仍然值得进一步的深入研究。内质网应激是细胞生存或凋亡的调控枢纽,已被证实在多种疾病的发生过程中发挥了重要作用。我们前期研究发现细胞凋亡是肥胖诱导的男性生育力降低的机制之一,内质网应激可导致细胞凋亡,然而内质网应激是否参与了肥胖导致的男性生育力降低的发生过程,目前尚无相关研究。近来有研究发现,沉默信息调节因子2相关酶1（SIRT1）可抑制内质网应激的过度激活,避免细胞走向死亡的命运,这表明SIRT1是内质网应激的抑制因子。C1q/肿瘤坏死因子相关蛋白3（CTRP3）作为一种脂联素类似物,在多种肥胖相关疾病中发挥重要作用。此外,CTRP3可以上调SIRT1的表达。然而,CTRP3在肥胖导致的男性不育中的作用尚未见相关报道。因此,本研究旨在探讨CTRP3是否可通过SIRT1调控高脂饮食诱导的生精功能障碍中的作用,以期发现男性不育的新的治疗靶点。方法第一部分:选取C57BL成年雄性小鼠（8-10周龄,体重22-25g）作为研究对象,高脂饮食24周构建小鼠生精功能障碍模型,利用免疫荧光染色,western-blot和RT-PCR等手段检测小鼠睾丸组织中CTRP3的表达改变。分离正常小鼠和高脂饮食小鼠睾丸组织中的支持细胞、间质细胞和精子细胞,RT-PCR检测上述三种细胞中CTRP3 m RNA的表达改变。ELISA检测正常小鼠和高脂饮食小鼠精子细胞CTRP3分泌情况的改变。向体外培养的精子细胞培养基中添加CTRP3特异性中和抗体,检测精子存活率的改变。第二部分:选取C57BL成年雄性小鼠（8-10周龄,体重22-25g）作为研究对象,高脂饮食20周后,利用皮下植入渗透性微泵补充外源性CTRP3蛋白4周,检测CTRP3干预后小鼠生精功能的改变,主要评价指标为:单侧睾丸重量/体重,小鼠睾丸组织形态学改变,小鼠精子计数,精子存活率和活动度的检测,血清睾酮水平的改变。合笼实验评价小鼠妊娠率和胚胎吸收率的改变。Western-blot检测睾丸组织中内质网应激标志物XBP-1,CHOP,GRP78,ATF6和SIRT1的表达改变。免疫荧光染色检测睾丸组织CHOP的表达改变。TUNEL染色检测睾丸组织中细胞的凋亡情况。第三部分:选取TM4小鼠睾丸支持细胞和TM3小鼠睾丸间质细胞作为研究对象,将其分别与PA共培养以模拟体内的高脂环境,在此基础上给予CTRP3进行干预,CCK8检测TM4和TM3细胞活性的改变,免疫荧光检测TM4小鼠睾丸支持细胞标志物Vimentin和Gata4的表达改变,ELISA检测TM3细胞睾酮分泌水平的改变。分离正常小鼠精子细胞,在含有或没有CTRP3的培养基中将其与PA共培养,检测精子细胞存活率和活动度的改变。Western-blot检测精子细胞中SIRT1的表达改变。构建生殖细胞特异性Sirtuin1敲除小鼠,分离小鼠精子细胞并将其与PA共培养,再给予CTRP3进行干预,检测精子存活率和活动度的改变,western-blot检测内质网应激标志物XBP-1,CHOP,GRP78和ATF6的表达改变。选取生殖细胞特异性Sirtuin1敲除小鼠作为研究对象,在高脂饮食喂养的基础上给予CTRP3干预,HE染色评价小鼠睾丸组织形态学改变,并检测小鼠精子细胞存活率和活动度的改变。第四部分:分别收集正常男性,肥胖但生育力正常,肥胖伴有生育力下降的三类男性的精液标本,western-blot检测CTRP3,SIRT1和内质网应激标志物XBP-1,CHOP,GRP78和ATF6的表达改变。留取正常男性的精子细胞,将其在体外与PA共培养,并使用SIRT1特异性抑制剂EX-527进行干预,检测精子存活率和活动度的改变,western-blot检测内质网应激标志物XBP-1,CHOP,GRP78和ATF6的表达改变。结果1.与正常对照组相比,CTRP3在高脂饮食小鼠睾丸组织中表达降低。与正常对照组相比,高脂饮食小鼠睾丸间质细胞和精子细胞中CTRP3的表达显著降低,且在精子细胞中的表达降低尤为显著。在精子培养基内加入CTRP3抗体阻断CTRP3之后,小鼠精子细胞的存活率降低。2.CTRP3干预2周和4周后,小鼠睾丸组织中CTRP3表达上调,且在CTRP3干预4周之后CTRP3表达上调更加明显。与高脂饮食组相比,CTRP3干预后,小鼠的生精功能明显改善,主要表现为睾丸重量/体重增加,睾丸组织形态学显著改善,精子存活率和活动度升高,妊娠率升高和胚胎吸收率降低。Western-blot检测显示,高脂饮食小鼠睾丸组织内质网应激标志物的表达上调,CTRP3干预之后,内质网应激标志物的表达下调。免疫荧光染色显示,高脂饮食组小鼠睾丸组织CHOP的表达上调,CTRP3干预之后,CHOP表达下降。TUNEL染色显示,高脂饮食后,小鼠睾丸组织中细胞凋亡增加,CTRP3干预之后细胞凋亡降低。Western-blot检测显示,高脂饮食组小鼠睾丸组织中SIRT1表达降低,CTRP3干预之后SIRT1表达升高。3.与PA组相比,CTRP3干预之后TM4小鼠睾丸支持细胞活性无明显改变,TM4细胞标志物Vimentin和Gata4表达无明显改变。与PA组相比,CTRP3干预之后TM3小鼠睾丸间质细胞活性无明显改变,TM3细胞睾酮分泌水平无明显改变。与PA组相比,CTRP3干预之后小鼠精子细胞存活率和活动度升高。Western-blot检测结果显示,与PA组相比,CTRP3干预之后小鼠精子细胞中SIRT1表达上调。与正常小鼠精子细胞相比,Sirtuin1敲除之后CTRP3对PA引起的精子细胞存活率和活动度降低的保护作用消失。Western-blot检测结果显示,CTRP3对内质网应激的抑制作用也在Sirtuin1敲除之后消失。与正常小鼠相比,CTRP3对高脂饮食诱导的生精功能受损在Sirtuin1敲除之后消失,高脂饮食引起的睾丸组织形态学受损及精子存活率和活动度的降低无明显改变。4.Western-blot检测结果显示,在肥胖伴有生育力下降的男性精液标本中CTRP3表达降低,SIRT1表达下调,内质网应激标志物XBP-1,CHOP,GRP78和ATF6表达升高。使用SIRT1抑制剂干预之后,CTRP3对PA诱导的人精子细胞存活率和活动度降低的保护作用消失。Western-blot检测结果显示,使用SIRT1抑制剂干预之后,CTRP3对PA引起的内质网应激过度激活的抑制作用消失。结论1.CTRP3在高脂饮食小鼠睾丸组织中表达下降,且在精子细胞中表达下降尤为显著,高脂饮食组小鼠精子细胞CTRP3分泌水平降低,阻断CTRP3可引起小鼠精子存活率降低2.CTRP3干预可改善高脂饮食引起的雄性小鼠生精功能受损,并且是通过激活SIRT1和抑制内质网应激发挥作用的3.精子细胞是CTRP3发挥保护作用的靶细胞,Sirtuin1敲除之后,CTRP3的精子保护作用消失,其对内质网应激的抑制作用消失4.CTRP3在肥胖伴有生育力下降的男性精液中表达降低,同时伴有SIRT1表达下调和内质网应激的激活。SIRT1抑制剂干预之后,CTRP3对PA诱导的精子损伤的保护作用消失