【摘 要】
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研究背景糖尿病是以糖代谢紊乱为主要临床表现的慢性病。空腹血糖升高是糖代谢紊乱表现之一,主要由肝脏糖异生增加所致。临床和基础研究均证实,二甲双胍可以有效抑制肝脏糖异生而降低空腹血糖,是糖尿病治疗的一线口服用药,但具体机制尚不明确。探究二甲双胍抑制肝脏糖异生的分子机制对于指导临床用药、优化药物设计及开发新型降糖药都有重要意义。二甲双胍抑制肝脏糖异生的机制主要有肝脏AMPK依赖理论、线粒体呼吸链的磷酸腺
【基金项目】
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美国NIH项目； 广东省胃肠疾病研究中心（No.2017B02029003）； 2014广州市“菁英计划”项目；
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研究背景糖尿病是以糖代谢紊乱为主要临床表现的慢性病。空腹血糖升高是糖代谢紊乱表现之一,主要由肝脏糖异生增加所致。临床和基础研究均证实,二甲双胍可以有效抑制肝脏糖异生而降低空腹血糖,是糖尿病治疗的一线口服用药,但具体机制尚不明确。探究二甲双胍抑制肝脏糖异生的分子机制对于指导临床用药、优化药物设计及开发新型降糖药都有重要意义。二甲双胍抑制肝脏糖异生的机制主要有肝脏AMPK依赖理论、线粒体呼吸链的磷酸腺苷理论、线粒体G3PDH依赖理论和肠道-大脑-肝脏神经调控理论。综合各项研究有以下几点需要完善:（1）多数研究使用远超过正常药理浓度进行实验,特别是基于细胞水平的实验;（2）部分研究使用非高血糖、糖尿病动物模型进行探究,与疾病模型不够吻合;（3）有些研究使用急性模型探究几小时内药效机制,不宜推论临床中二甲双胍长期服用慢性起效机制;（4）多数研究主要基于细胞水平得出实验结论,尚缺乏在优化的动物模型上的验证。据此,我们提出假说:二甲双胍抑制肝脏糖异生机制的不同解释可能是由于实验设计差异所致,包括用药剂量、模型构建、疗效评估等因素。结合课题组前期研究成果,我们继续支持二甲双胍肝脏AMPK依赖理论。研究目的根据我们的假说,本研究将规范实验方法,完善疾病模型诱导,借助AMPK转基因小鼠模型,探讨二甲双胍抑制肝脏糖异生的作用机制。研究内容1.构建多基因转基因动物模型。2.特异性敲除小鼠肝脏AMPK,进行糖代谢相关耐量实验,探究二甲双胍是否通过AMPK通路起作用并探究AMPK在肝脏糖异生中的调节作用。3.分别探究AMPKα 1和α 2单亚基异构体的功能,以进一步探究二甲双胍的作用靶点。4.在慢性模型中对肠道-大脑-肝脏神经调控机制进行验证探究。研究方法1.通过反复多重交配和基因型鉴定筛选得到多基因转基因动物模型。2.按照随机、对照、重复原则,对多组转基因小鼠,进行病毒诱导特异性敲除肝脏AMPK,对比评估糖代谢变化,探究二甲双胍作用机制。部分实验使用高脂饲料来诱导高血糖模型,使用二甲双胍饮水进行药物治疗。3.观察指标及评估:首先通过体内糖代谢相关耐量实验评估小鼠糖异生水平、葡萄糖耐量、胰岛素敏感性,再通过Western Blot和mRNA定量对肝脏组织基因表达水平进行检测验证。4.统计分析:采用Excel和Graph Pad Prism软件进行数据分析和作图。每组对至少3个重复数据进行统计学分析,定量数值采用均值+/-标准差表示,组间差异比较使用双尾独立t检验。P＜0.05被认为有统计学差异。创新特色1.在转基因动物水平,条件诱导特异性敲除肝脏AMPK进行实验探究。2.使用改进的疾病模型进行实验探究:高脂饲料诱导和正常二甲双胍治疗剂量。3.首次对肝脏AMPK α亚基的不同异构体进行功能探究。结果和结论1.肝脏AMPK敲除减弱了二甲双胍对高脂饮食小鼠糖异生的抑制,说明二甲双胍抑制肝脏糖异生是AMPK途径依赖的。2.对正常饮食及高脂饮食的小鼠,短期肝脏AMPK敲除不改变肝脏基础糖代谢水平。3.单独敲除肝脏AMPK α任一异构体对二甲双胍抑制肝脏糖异生无明显影响。肝脏AMPK α 1亚基和α 2亚基功能相近,存在互补代偿,两者在二甲双胍抑制肝脏糖异生中均发挥重要角色;α 1可能较α2有更独特功能,尚待开展进一步实验进行探究。4.在慢性模型中,肠道-大脑-肝脏神经通路被阻断后,二甲双胍依然可以通过肝脏AMPK抑制肝脏糖异生。该急性理论尚不能解释慢性模型中二甲双胍抑制糖异生的作用机制。不足和展望本研究未检测到二甲双胍治疗后AMPK敲除对空腹血糖水平的影响,高脂饲料模型诱导时间和AMPK敲除后二甲双胍治疗时间是可能的影响因素,有待进一步探究。研究结论待在AMPK转基因糖尿病小鼠模型上验证推广。二甲双胍与AMPK是否有直接相互作用及寻找相互作用靶点,是后续深入研究的方向。长期AMPK敲除对肝脏糖异生的影响及AMPK α单亚基异构体功能也值得进一步探究。同时,可以考虑利用本研究构建的动物模型对机制理论二进行探究。
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