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目的： 随着交通的发展和体育活动的普及，韧带损伤的发病率有升高的趋势，常需在关节镜下手术处理。目前，韧带重建的方法很多，但应用最多的还是使用骨-髌腱-骨(BPTB)及胭绳肌腱进行重建的方法。骨-髌腱-骨移植后的并发症相对胭绳肌腱移植略多，故越来越多的医生选择胭绳肌腱移植。重建后韧带的止点重建对于恢复韧带的生理功能非常重要。韧带止点分为间接止点和直接止点。挤压固定可以在腱、骨之间形成直接愈合，悬吊固定形成间接愈合。重建后移植肌腱在骨隧道内理想的愈合方式应为类似正常韧带止点结构的直接连接。任何坚强的固定只要移植物与隧道未牢固愈合之前，始终存在固定失败的可能，故越来越多的学者认识到加强和加快肌腱在骨隧道内愈合的重要性。 BMP-2是BMP(bone morphogenetic protein)家族的成员之一，是可溶解并在局部起作用的蛋白，最初因其成骨活性而被发现，最近又发现它有较强的成软骨特性，已广泛应用于骨缺损治疗，但对韧带重建时腱-骨愈合作用的研究很少。有学者用BMP-2处理移植肌腱，植入骨隧道，观察腱-骨愈合。结果显示，骨隧道内的新生骨长入移植肌腱，腱-骨间的愈合明显优于对照组，8周时腱-骨间有直接连接，他们认为经BMP-2处理的移植肌腱在骨隧道内能直接愈合。 运用骨髓间充质干细胞促进腱-骨愈合是一种新方法，能潜在地提供更大生理学和生物力学强度的韧带重建。有学者用骨髓间充质干细胞处理的肌腱重建韧带，组织学特征类似于兔正常ACL末端结构。由此可见，骨髓间充质干细胞可以促进腱骨之间形成直接愈合。 利用基因工程促进腱-骨愈合是一种新的方法，也是当前的研究热点之一，具有很大的发展前景。本实验是将外源目的基因片段(BMP-2)同载体分子(pcDNA3.1)重组，构成pcDNA3.1一BMP-2表达载体。再将提纯这种含有BMP-2基因的表达载体通过脂质体介导转染兔骨髓基质干细胞，在体外把获得的稳定表达BMP-2的细胞克隆，筛选传代，培育扩增，实现外源基因BMP-2的稳定表达。这种可以表达外源基因BMP-2的骨髓基质干细胞被植入兔关节外悬吊固定的韧带重建模型后，8周时就出现了软骨带，12周形成了近似直接愈合的止点结构。为研究腱骨愈合提供了新的思路。 方法： 一、BMP-2基因转染兔骨髓基质干细胞及其表达 1、 BMSCs的分离、培养和体外扩增 用贴壁培养法、分离、纯化兔骨髓间充质干细胞，进行体外培养扩增，显微镜每日观察细胞的生长情况。 2、 BMSCs的鉴定 BMSC可表达多种表面抗原，本实验选取CD44、CD109作为其鉴定标记。 3、构建稳定表达pcDNA3.1-BMP-2-BMSCs的细胞株（菌液受赠于盛京医院李建军博士）引物设计:BMP-2:上游引物F5-CGTGTCCCCGCGTGCTTCTT3。下游引物R5-GGCGTGTCCCTGTGCAGTCC-3片段长度:716bpβ-actin:上游引物F5-CTGATCGTGCCTGTCTATCGT-3下游引物R5-CAGATTCGCGATTCCAGTGT-3片段长度:511bp利用阳离子脂质体Lipofectamine2000介导的基因转染法将真核表达质粒pcDNA3.1-BMP-2转入BMSCs。利用G418筛选，获得稳定转染株。 4、转染后BMSCs对BMP-2的表达 利用RT-PCR检测转染后BMSCs对BMP-2基因的表达。 利用Western blot法检测转染后BMSCs对BMP-2蛋白水平的表达。 二、转基因BMSCs移植对悬吊固定韧带重建模型愈合方式的影响 1、动物模型的建立 实验动物购于沈阳药科大学。随机分为三组，每组的左下肢为实验侧，右下肢为对照侧。构建关节外韧带重建模型。实验侧骨道内植入转基因BMSCs0.5ml，浓度为40×104。 2、观察腱骨愈合方式的不同 每组分别在术后4、8、12周处死。取下胫骨骨道标本后置10％甲醛缓冲溶液固定脱钙后石蜡包埋。平行和垂直于骨道方向作切片。采用苏木精-伊红染色。特别观察骨隧道和肌腱移植物间的界面组织，并纪录在不同时段腱-骨界面的形态和特殊的组织学发现，探讨这些形态学变化所提供的腱-骨愈合信息。 结果： 1、第一部分BMP-2基因转染兔骨髓基质干细胞及其表达 BMSCs原代培养:细胞刚接种时，大部分细胞悬浮于培养液中，后经换液去除未贴壁细胞，72小时左右，贴壁细胞开始增殖并形成细胞集落，细胞常围绕集落中央并呈岛状向四周分布，细胞形态多样。消化传代后，细胞增殖速度加快，随着传代次数增加，细胞形态趋于均一，多为长梭形，并呈漩涡或平行状排列生长。 免疫荧光试验的结果显示在中，抗原决定簇CD44、CD109弥散分布于细胞膜表面，在荧光显微镜下细胞膜表面被激发出绿色荧光。 RT-PCR电泳结果显示，稳定转染pcDNA3.1-BMP-2组的细胞电泳结果在716bp的位置出现一特异性条带且灰度较高，说明稳定转染细胞的mRNA中BMP-2有表达，稳定转染成功，BMP-2 mRNA水平表达较高。 Western blot结果显示，稳定转染细胞组有BMP-2的特异性表达，分子量大小14KD，BMP-2成功翻译为蛋白，稳定转染获得成功。 2、第二部分转基因BMSCs移植对悬吊固定韧带重建模型愈合方式的影响 实验组与对照组在四周时无明显差异。八周时对照组切片腱骨相连，骨道与移植肌腱之间有纤维结构相连，呈现间接愈合趋势。实验组腱骨之间出现了软骨带，但是没有直接愈合的典型结构。十二周时对照组纤维结构形成较八周明显增加，在部分区域和切片可以发现典型的Sharpey纤维，但没有典型的直接连接形态和软骨细胞堆形成。实验组腱-骨间有直接连接结构，观察到排列不典型的直接连接的四层结构。 结论： 1、成功将BMP-2基因转染入兔骨髓基质干细胞，经RT-PCR和Western blot技术检测，可以获得稳定表达。 2、转基因BMSCs移植促进悬吊固定韧带重建模型形成直接愈合。