目的:癫痫作为一种复杂的神经系统性疾病,是由大脑中神经元的异常放电并产生神经兴奋性引起的,其发病率高、发作类型多,且发病机制较为复杂。目前对其发病机制的研究主要集中在离子通道、神经胶质细胞和神经递质等的异常方面,且具体机制并不清楚。Ca²⁺/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II（Calcium/Calmodulin-dependent protein kinase II,CaMKII）属于一种多功能丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,它的全酶由四个亚基组成,分别是α、β、γ和δ,共形成30多种亚型,因此CaMKII的功能广泛,在机体多种疾病的发展过程中发挥不可忽视的作用。KN93是CaMKII特异性的抑制剂,它可渗透细胞,从而抑制CaMKII的磷酸化活性。研究发现,在遗传性癫痫大鼠（Tremor,TRM）和震颤大鼠的海马组织中磷酸化的CaMKII蛋白表达明显减少。但目前为止,CaMKII的抑制剂KN93对神经细胞的作用及其机制尚不明确。转录因子NF-E2相关因子2（Nrf2）是帽和领（cap’n’collar,CNC）家族的转录因子之一,该家族还包括Nrf1,Nrf3、p45、p53、Bach1和Bach2,其中Nrf2为活性最强的调节因子。Nrf2是一个由2.2kb的碱基对编码的相对分子质量为66000的蛋白,它有六个红细胞衍生的CNC同源蛋白（ECH）域名,为Neh1至Neh6。据报道Nrf2在各种器官组织中发挥广泛的作用,包括心脏、肾脏、肝脏和大脑。最重要的是,Nrf2在神经保护中发挥重要角色。以往的研究显示,Nrf2受几种上游因子的调控,例如以萝卜硫素（SFN）,富马酸二甲酯（DMF）以及合成的三萜类化合物为代表的物质。与此同时,Nrf2还能调节其下游的许多保护性蛋白,常见的有血红素加氧合酶-1（HO-1）,醌氧化还原酶-1（NQO1）,NAD（P）H和硫氧环蛋白（Trxs）这些第二阶段的抗氧化酶,结合药物代谢物或内毒素。这些结果表明Nrf2介导复杂的信号通路参与神经保护。Nrf2已被证明可以保护几种类型细胞伴随的急性和慢性氧化应激损伤,氧化应激是生物体内一个普遍存在的过程,它参与机体许多器官和组织在生理和病理状态的发展。Tasaki报道了通过化学产生的氧化应激反应产生的有毒物质可能促进其增殖和肿瘤前病变到肿瘤的过程,在Nrf2缺陷小鼠中其程度更大。此外,慢性氧化应激被证明是慢性肾脏病（CKD）的主要调解者,而Nrf2活动的恢复可能会减少肾小球硬化,CKD大鼠的间质纤维化和炎症。最近,Hyeon研究了Nrf2在破骨细胞中的分化作用,然后参与活性氧（ROS）的生成过程,揭示Nrf2可能会抑制核因子κB配体（RANKL）的受体激活剂,并通过控制破坏细胞的氧化应答表达从而诱导破骨细胞的分化。此外,证据表明氧化应激有助于改善中风,Nrf2的激活可以改善氧化应激引起的损伤脑内皮细胞,同时防止其紧密连接,从而减少蛋白质,达到保护血脑屏障（blood–brain barrier,BBB）的目的。而Nrf2通路与CaMKII的抑制剂KN93诱导的神经细胞的作用之间的关系目前还不清楚。在此基础上,本研究通过细胞培养、膜片钳技术和一系列分子生物学方法揭示KN93对神经细胞的作用及其兴奋性的变化,明确KN93对神经细胞的毒性作用及其与Nrf2通路之间的关系,进一步阐明CaMKII的抑制剂KN93诱导的毒性机制,为癫痫的发病机理提供理论基础和实验依据。研究方法:1.原代海马神经元培养将怀孕18天的Wistar大鼠,经过手术,取出胎鼠,对其进行麻醉,并取出脑组织,浸泡在4度的Hank’s液中。在解剖显微镜下剥离海马组织,并用细胞培养基（Hyclone DME/F-12）将组织清洗两到三次。根据组织的数量,取适量的胰酶进行消化,37℃进行30 min,每10 min充分震摇一次,最后用等量的将种植液（20%血清培养液）按1:1加入,终止消化。1000rmp离心5 min,获得细胞沉淀,加神经元培养液,在计数完成后将细胞种植在培养板中。大多数细胞贴壁后,每24小时半饲量换液。培养7-9天观察神经元状态后进行后续实验。2.神经细胞系培养将冻存细胞在37℃条件下复苏30分钟,加入细胞培养液。当细胞密度达到80-90%时开始传代,弃掉原来的细胞培养液,缓缓加入复温的培养基清洗两到三次,去除坏死细胞及其代谢物。加入胰酶消化至细胞从壁上脱落,加入有血清培养液结束消化过程,并进行传代。3.CCK8（Cell Counting Kit 8）细胞毒性实验将消化完成的细胞悬液,进行计数,然后种植在96孔板中,每孔约3000-5000个细胞,并均匀混合。待细胞培养至成熟状态,按照0、2、5、20、100、500、1000μM的KN93浓度梯度给药12或24小时。加入CCK-8试剂（100μL/mL）,在37℃继续孵育2小时,用酶标仪测定样品在450 nm处的吸光值,通过吸光度值及公式计算各实验组细胞的存活率。4.免疫荧光培养神经元时,将细胞种植在细胞爬片（WBS）,培养成熟后,用浓度为4%的多聚甲醛固定30 min,固定结束后用PBS洗去表面残留。再用浓度为3%的BSA进行封闭,30 min后,取NeuN一抗稀释液（Abcam）50μL,均匀滴在细胞爬片上,在4℃条件下,湿盒孵育过夜。一抗孵育结束后,用PBS洗去残留,加入FITC荧光二抗稀释液（中杉金桥）孵育1.5小时。再次重复上述清洗步骤,用DAPI原液进行染核10 min,取出细胞爬片,用封片剂进行封片,到共聚焦显微镜下拍摄神经元中NeuN和细胞核的定位及表达。5.免疫印迹（Western Blot,WB）实验法将细胞样品从CO₂培养箱中取出,去掉培养液,将提前配制好的细胞裂解液（RAPI:PMSF=1000:1）加入到六孔板中,按每孔150μL,用细胞刮刀使大部分细胞脱离培养板内壁,4℃裂解30 min,将样品加到尖头EP管中,用低温离心机12000转离心20 min,将最终得到的上清液进行蛋白浓度测定。加入样品体积四分之一的5×Loading Buffer,然后放到干式恒温仪上100℃加热10 min,使蛋白变性。配制丙烯酰胺凝胶,进行上样、电泳以及转膜。湿转结束后,将PVDF膜浸泡在5%脱脂牛奶中,室温振摇封闭30min,用洗膜液TBST洗去表面残留,加入按照比例稀释好的一抗溶液,将一抗4℃孵育过夜,结束后用TBST溶液洗去多余抗体,进行与一抗对应的二抗孵育,通常在室温条件下孵育2小时,再次用TBST溶液洗去多余抗体。配制ECL发光液（Biorad）即A液和B液1:1混合,均匀滴在PVDF膜上,通过成像系统拍摄结果照片。6.ElISA试剂盒取出提前种好的六孔细胞培养板,吸取上清液,制备样品。按照说明书要求稀释标准品,然后在酶标板中加入空白对照和样品,37℃温育30 min,弃去样品,用提前配制好的洗涤液,洗涤五遍,拍干。每孔加入酶标试剂50μL,空白除外,温育、洗涤,每孔加入显色剂A50μL+显色剂B50μL,避光,37℃恒温水浴10 min,然后每孔加入50μL终止液,使反应停止。用酶标仪进行测定,450nm波长测量各空吸光度（OD值）,并以空白孔调零,进行计算。7.膜片钳技术运用全细胞膜片钳技术在当前钳模式下进行细胞动作电位的研究。在斜坡模式下,通过注入最大电流为200 pA的1-s去极化电流来诱发动作电位。膜电位钳制在-70 mV,用于诱发动作电位激发测量。记录以5 kHz的低通贝塞尔（Bessel）滤波并以50 kHz数字化。对于电压钳记录,使用Multiclamp 700B放大器和pClamp 10.2软件（Molecular Devices）将盖玻片上培养的大鼠海马神经元（DIV15-21）破裂,并在室温下保持在-70 m V。使用P-97拔除器（Sutter Instrument）按四步规程拉出记录移液器（1.5?2.5 MΩ）,并用MF-900微型锻造器（Narishige）进行火抛光。所有实验均在室温（22±2℃）下进行。8.统计分析将Western Blot免疫印迹实验中获得的PVDF膜通过成像技术拍摄照片,通过Image J将其转换成灰度值,并对其标准化处理。使用Prism 6软件绘制统计图,并对实验各组多重比较结果进行标注。统计方法以学生氏t检验和方差分析为主,提取数据为平均值+标准差,结果显示P<0.05具有统计学差异,P<0.01具有显著性差异。结果:1.KN93给药处理对神经细胞具有毒性作用利用CCK8试剂盒,将KN93按照0、2、5、20、100、500、1000μmol的浓度梯度给药12或24小时后进行浓度与细胞存活率的测定。随KN93浓度升高细胞存活率不断下降,并从KN93浓度为5μmol开始,可以看出细胞存活率下降具有统计学差异。通过免疫荧光染色法发现,当KN93给药5μmol时,原代海马神经元中NeuN染色的阳性细胞明显减少。因此,KN93给药能对细胞产生毒性作用。2.KN93给药处理对原代海马神经元动作电位及神经兴奋性的影响利用全细胞膜片钳技术,检测原代海马神经元对照组,KN93浓度5μmol给药1h,KN93浓度5μmol给药24h和KN92浓度5μmol给药24h实验组动作电位和峰值的记录,KN93浓度5μmol给药24 h的细胞兴奋性升高并具有统计学意义。3.KN93给药处理12小时对炎症相关因子的表达为了进一步了解12小时KN93给药对神经细胞的毒性作用,我们检测了实验各组炎症相关因子NF-κB、IL-6、TNF-α、IL-1β的蛋白表达。在KN93给药处理12小时的神经细胞中,我们发现其炎症相关的表达明显增加。说明KN93诱导的神经细胞毒性作用可能与炎症反应相关。4.KN93给药处理12小时对Nrf2表达的影响在此基础上,通过Western Blot实验法进行验证,发现Nrf2蛋白表达增加,此结果在海马神经元、Neuro-2a（即N2a）、SH-SY5Y细胞中是一致的,表明KN93给药后12小时激活Nrf2信号通路（n=6）。5.Nrf2拮抗剂ML385给药后对Nrf2及炎症相关蛋白表达的影响KN93和Nrf2拮抗剂ML385同时处理组炎症相关蛋白表达下降且具有统计学意义,阴性对照组即单独ML385给药组与对照组相比无变化,表明钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ的抑制剂KN93给药后12小时改变炎症相关蛋白的表达,而Nrf2的抑制剂ML385能逆转这种改变。结论:首先,我们通过CCK8试剂盒检测了KN93不同给药浓度下细胞的存活率,然后进行荧光NeuN染色和全细胞膜片钳揭示了KN93对神经细胞的作用,最后从蛋白表达层面,用Western Blot免疫印迹和ELISA试剂盒检测相关蛋白的表达。结果显示CaMKII的抑制剂KN93给药处理后12小时可诱导神经细胞对炎症相关指标的表达上调。为了进一步探究KN93给药后12小时的作用机制,引入Nrf2及其抑制剂ML385验证KN93对神经细胞的毒性作用机制,并发现KN93引起神经细胞的兴奋性变化。数据显示,Nrf2的抑制剂ML385对KN93给药处理12小时所导致的细胞炎症反应具有反转作用,说明ML385可调节KN93引起的神经细胞毒性作用。因此,我们关注KN93给药处理12小时与Nrf2的关系以及Nrf2的抑制剂ML385对其神经细胞炎症反应的逆转和作用机制。在下一步的工作中,我们将进一步探究Nrf2抑制剂ML385与KN93共同给药对CaMKII蛋白磷酸化活性的影响。综上所述,本研究初步揭示KN93对神经细胞的毒性作用与炎症反应相关,并且由Nrf2通路的参与,为癫痫发病机制的研究和抗癫痫药物新靶点的寻找提供理论和实验依据。