草鱼（Ctenopharyngodon Idella）年产超过五百万吨,广泛分布于我国各地,草鱼养殖业产值约为每年700亿至800亿元,是我国主要的淡水养殖鱼类品种之一。草鱼出血病作为我国农业农村部所认定的二类动物疫病,每年给我国的草鱼养殖业带来巨大的经济损失,对于草鱼水产养殖行业造成了极为迫切的威胁。草鱼呼肠孤病毒（Grass carp reovirus,GCRV）是草鱼出血病的主要病毒性病原体。目前已分离并鉴定的数十株草鱼呼肠孤病毒中,根据S6片段同源性可分为Ⅰ型、IⅠ型和IIⅠ型三种基因型,代表株分别为GCRV-873、GCRV-HZ08和GCRV-104[1]。草鱼Ⅰ型呼肠孤病毒S7片段编码非结构蛋白NS12作为最新被发现的病毒蛋白,其具体生物功能尚不明确。蛋白酶体广泛存在于真核生物细胞的蛋白质复合物中,并且是蛋白质降解的主要引擎。蛋白酶体是一种多催化复合物,参与各种细胞过程,如真核生物中的蛋白质和RNA转化,细胞分裂,信号转导,转录和翻译。细胞内病原体是其酶活性的目标,已知许多动物病毒会干扰这些酶的活性。Myosin-9参与细胞分裂、细胞运动、细胞形态维持、细胞吞噬和凋亡,Myosin-9与各种疾病的发生发展有着千丝万缕的联系,并参与了一些人类癌症的进展。本研究利用酵母双杂交技术、GST-Pulldown与免疫共沉淀联用发现了草鱼PSMB7以及草鱼Myosin-9与草鱼Ⅰ型呼肠孤病毒非结构蛋白NS12存在潜在相互作用,并利用多种分子生物学技术验证了草鱼Ⅰ型呼肠孤病毒非结构蛋白NS12与上述PSMB7蛋白以及Myosin-9蛋白之间的相互作用。具体研究内容如下:1.利用酵母双杂交技术筛选与草鱼Ⅰ型呼肠孤病毒非结构蛋白NS12相互作用的宿主蛋白我们使用酵母双杂交技术筛选能与草鱼Ⅰ型呼肠孤病毒非结构蛋白NS12相互作用的草鱼宿主蛋白。利用PCR技术扩增GCRV-JX01NS12基因片段,构建诱饵质粒p GBKT7-NS12;对重组诱饵质粒p GBKT7-NS12进行自激活检测,以病毒非结构蛋白NS12蛋白作为诱饵在草鱼c DNA文库质粒中筛选与其相互作用的草鱼宿主蛋白,对呈现蓝绿色的阳性菌落进行质粒提取并送公司测序。结果表明重组诱饵质粒NS12并无自激活反应,NS12没有转录活性;诱饵质粒p GBKT7-NS12筛选得到10株阳性克隆,分别编码β肌动蛋白、F肌动蛋白加帽蛋白亚基α1、TAR DNA结合蛋白43、N-酰基磷脂酰乙醇胺水解磷脂酶D、grp E蛋白同源物2、RNA结合蛋白48、核受体共激活子4、蛋白酶受体亚基β7、黑素转铁蛋白和NADH-泛醌氧化还原酶75 k Da亚基。2.草鱼Ⅰ型呼肠孤病毒非结构蛋白NS12与蛋白酶体亚基β7（Proteasome subnit beta type 7,PSMB7）的相互作用利用定向酵母双杂交技术、GST-pulldown、细胞内共定位等技术探究了NS12与PSMB7之间的相互作用;利用脂质体介导转染技术在草鱼卵巢细胞（GCO）中过表达PSMB7后感染GCRV-JX01,利用realtime RT-PCR对病毒感染后过表达PSMB7的GCO细胞中NS12转录水平的表达量进行检测。结果表明PSMB7与草鱼Ⅰ型呼肠孤病毒非结构蛋白NS12存在相互作用;过表达PSMB7能上调NS12在感染GCRV-JX01后细胞内的转录水平表达量。3.草鱼Ⅰ型呼肠孤病毒非结构蛋白NS12与草鱼肌球蛋白9（Myosin-9）的相互作用利用GST-pulldown、免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation,CO-IP）、蛋白质质谱分析等技术在草鱼卵巢细胞中（GCO）中筛选与其相互作用的宿主蛋白;对筛选得到提取液进行蛋白质质谱测序;利用Western blot及realtime RT-PCR对病毒感染后GCO细胞中Myosin-9在翻译水平和转录水平上的表达量进行了检测;利用RNAi干扰技术敲降了Myosin-9在草鱼卵巢细胞（GCO）中的表达量,并进行病毒感染。结果表明GCRVJX01感染后Myosin-9在转录水平下调,敲降Myosin-9能够下调NS12在宿主细胞内转录水平和翻译水平的表达。本研究利用酵母双杂交技术和GSTpulldown-CO-IP联用筛选了与GCRV-JX01编码非结构蛋白NS12存在相互作用的宿主蛋白,对NS12进行了可溶性原核表达,利用多种实验技术验证了PSMB7及Myosin-9与草鱼Ⅰ型呼肠孤病毒非结构蛋白NS12的相互作用,探究了PSMB7与Myosin-9在病毒感染后在转录水平的表达量变化以及PSMB7与Myosin-9对病毒非结构蛋白NS12在细胞中的表达量变化影响,为进一步了解GCRV感染机制提供了一定的理论依据。