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目的:研究眼镜蛇毒Cobrotoxin(CbT)的镇痛作用和对小鼠背根神经节(DRG)神经元细胞兴奋性的影响及其离子通道作用机制。
方法:建立多种小鼠疼痛模型，从行为学的角度研究CbT的在体镇痛作用。培养小鼠背根神经节(DRG)神经元细胞，采用分子生物学的方法鉴定DRG神经元上M型乙酰胆碱(MAChR)受体类型的表达;利用全细胞膜片钳技术研究眼镜蛇毒CbT对小直径的DRG神经元T型钙电流和A型钾电流以及兴奋性放电的作用，并用药理学方法研究其信号通路作用机制;
结果:本实验研究发现:(1)行为学实验中发现，不论在炎症痛还是在非炎症痛模型中，CbT都能较为显著地提高小鼠的痛阈，产生镇痛效果;且这种镇痛作用也可被M3AChR阻断剂4-DAMP所翻转;(2)细胞兴奋性研究发现，CbT能够明显降低小直径背根神经节细胞的放电频率，抑制率为30.7％，且AP amplitude和first spike latency等参数也有显著差异。(3)不论在mRNA水平，还是蛋白水平，小鼠背根神经节上都有乙酰胆碱受体4种亚型的表达，而没有显示出烟碱受体α1的表达;(4)电生理研究表明，CbT对背根神经节细胞上的T型钙通道的抑制作用及对A型钾通道的增强作用都具有剂量依赖关系。1μM CbT对T型钙电流的抑制率约为27.4％，对A型钾电流的增长率约为30.3％;(5) CbT对T型钙通道和A型钾通道的影响能够被毒蕈碱胆碱受体(MAChR)拮抗剂阿托品或选择性M3AChR拮抗剂4-DAMP所阻断，阿片受体拮抗剂纳洛酮则不能阻断这种作用，同时，CbT的这些作用可以被GDP-β-S（特异性G蛋白活性抑制剂）、PTX（百日咳毒素）所阻断，表明CbT是通过Gi/οα亚基发挥作用;运用设置去极化前置脉冲的方法发现Gβγ亚基并不参与CbT对T型钙通道的调控;而电极内灌注anti-Gopeptide不能翻转CbT对A型钾电流的作用，说明CbT通过Giα调节A型钾通道。在下游信号通路方面，蛋白激酶C(PKC)的选择性阻断剂GF109203X、chelerythrinechloride和磷脂酶C(PLC)选择性阻断剂U73122可阻断CbT对T型钙通道的抑制作用，另外用PKCδ的阻断剂Rottlerin，以及ERK1/2通路阻断剂U0126、PD98059预先孵育背根神经节细胞后又可阻断CbT对A型钾通道的作用;而孵育蛋白激酶A（PKA）的选择性阻断剂H89和PKI6-22则都不能影响CbT的调节作用。
结论:在体注射CbT可显著提高小鼠的痛阈;CbT可抑制DRG神经元细胞膜的兴奋性;CbT是通过作用于小鼠小直径背根神经节神经元上的M3AChR来抑制T型钙通道和增强A型钾通道的;其对T型钙通道电流的抑制作用是通过PTX敏感的蛋白激酶C(PKC)启动的信号通路，而对A型钾通道的增强作用是通过Giα蛋白启动的PLC依赖的PKCδ及其下游的ERK1/2信号通路。