微生物来源的天然产物是一类具有多种生物活性的次级代谢产物,目前已成为药物及化学品的重要来源。微生物中负责生产调控天然产物的基因通常被压缩成几十到几百kb不等的大片段DNA,即这些基因组成几十到几百kb不等的生物合成基因簇（Biosynthetic gene clusters,BGC）。挖掘新颖结构的天然产物常见的一种策略便是准确高效克隆这些大型BGCs,进而实现其表达。常规的DNA克隆基于PCR分级扩增目的基因,随后利用DNA组装技术按照顺序组装。这类方法存在操作复杂、周期较长、效率低下、突变率高等问题。因此,亟需开发一款高效、准确、简易的大片段DNA克隆方法。CRISPR/Cas9系统仅需要Cas9核酸酶和工程sgRNA便可以高特异性靶向目的DNA。由于其高特异性和可编程性被广泛应用于基因编辑、细胞成像、医学治疗等各个领域。本研究以CRISPR/Cas9的高特异性靶向切割能力为基础开发大片段DNA克隆技术,从而规避传统方法酶切位点限制问题。首先通过gRNA在线设计软件筛选高效率编辑靶点,缓解了部分位点靶向切割效率低下的问题,降低了脱靶效应,节省了筛选高切割效率靶点的时间;其次,本研究采用CRISPR/Cas9系统直接切割基因组DNA,从基因组中直接获取目的DNA片段,从而避免PCR扩增限制以及突变等问题。利用酶解法处理细胞壁,并结合酚氯仿法抽提基因组DNA,该方法操作简单,获取的基因组完整度高,利于后续切割克隆及组装。本研究在大肠杆菌中采取了蓝白斑法进行克隆筛选并计算阳性率,通过设计双gRNA靶向切割分离基因组,然后利用NEBuilder一步式多片段无缝克隆方法进行质粒组装。我们首先选择一段15 kb含LacZ基因的DNA片段为目标,对CRISPR/Cas9介导的大片段DNA克隆涉及到的酶切体系、连接体系、同源臂长度等条件进行优化。结果表明,当体系中Cas9:gRNA:genome摩尔比例在5000:5000:1～10000:10000:1之间,且插入片段与载体DNA摩尔浓度为1:1时,克隆效率最高,接近100%。随后利用本方法逐次应用于30～100kb不同大小的DNA片段克隆:对50 kb以下大片段DNA克隆效率近100%,但当克隆DNA大于50 kb时,克隆效率迅速下降。尽管随着克隆DNA长度增加,克隆效率下降,但对77 kb的大片段DNA克隆仍有46%的效率。链霉菌是微生物天然产物的重要来源,因此本研究也将该方法成功应用于天蓝色链霉菌,并以93%的阳性率成功克隆了40 kb天蓝色链霉菌基因组大片段。本研究基于CRISPR/Cas9系统,设计了体外靶向识别并切割基因组DNA体系,结合NEBuilder无缝克隆技术连接大片段DNA和载体,实现了快速高效地构建大分子重组质粒。本方法较其他大片段DNA克隆技术具有简便、可操作性高、效率高、周期短等特点。