论文部分内容阅读
人体内许多组织和器官都受到来自生理环境的不同类型和大小的应力作用，骨是人体内重要的结构和功能组织，研究应力作用对骨组织生长发育的影响有助于骨组织修复工程的发展。应力刺激可以改变细胞内基因的表达和可变剪接过程，本文利用生物力学、分子生物学等手段研究拉伸刺激对成骨细胞内力响应基因的表达和可变剪接的影响，以及可能的可变剪接调控机制。主要研究内容和结果如下：培养小鼠成骨细胞株MC3T3-E1和人永生化表皮细胞株HaCaT，倒置显微镜下观察细胞生长状态良好，MC3T3-E1细胞呈纤维样细胞型，HaCaT细胞呈上皮样细胞型。将成骨细胞MC3T3-E1接种到硅橡胶膜上，应用自主设计制作的应力拉伸装置对MC3T3-E1细胞施加拉伸刺激，加载参数为：应变量15%、频率30次/min、加载时间分别为3h和6h，收集细胞提取总mRNA和蛋白，研究拉伸刺激对VEGF、CD44和cyclinD1基因表达的影响。RT-PCR检测发现拉伸前后VEGF基因主要表达剪接变异体VEGF188、VEGF164和VEGF120，CD44基因主要表达剪接变异体CD44S和CD44E，cyclinD1基因主要表达剪接变异体cyclinD1a。利用q-PCR和western blot检测表达量变化发现拉伸刺激后VEGF及其剪接变异体VEGF164和VEGF120表达量明显上调，cyclinD1及其剪接变异体cyclinD1a表达量明显下调，而CD44及其剪接变异体CD44S和CD44E表达量改变不明显。构建剪接因子ASF/SF2、SC35和hnRNPA1的真核表达质粒pcDNA3.1(+)-EGFP-ASF/SF2、pcDNA3.1(+)-EGFP-SC35和pcDNA3.1(+)-EGFP-hnRNPA1，转染HaCaT细胞以模拟拉伸刺激后细胞内剪接因子ASF/SF2、SC35和hnRNPA1表达上调的状态，研究应力拉伸环境下剪接因子ASF/SF2、SC35和hnRNPA1对VEGF基因可变剪接的影响。荧光显微镜下观察到表达质粒转染效率约70%，western blot检测ASF/SF2、SC35和hnRNPA1蛋白的表达，检测结果证明其表达量明显增加。且过表达ASF/SF2和SC35后VEGF剪接变异体VEGF188、VEGF164和VEGF120蛋白表达量显著下调，而过表达hnRNPA1对VEGF剪接变异体的表达改变不明显。说明ASF/SF2和SC35参与应力拉伸环境下对VEGF基因可变剪接的调控过程，而hnRNPA1不参与该过程。