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本文以水稻和基腐病菌互作系统为材料,探索了抗病和感病品种在病原菌侵染之后植株体内活性氧代谢变化;研究了水稻基腐病菌的侵染特点,首次发现水稻基腐病菌能产生毒素,并对毒素的分离纯化、生物活性和在致病性中的重要作用进行了较系统地研究;同时对毒素的遗传特性及其突变体的基因突变位点进行了初步分析。
通过病菌侵染水稻的研究表明,水稻基腐病菌可以从水稻不同生育期侵入,其中前期侵入,造成种子不发芽,出苗率降低,并明显抑制水稻根的生长。对未显症状的水稻中分离病菌的结果表明,基腐病菌具有潜伏侵染现象。
接种病菌后,抗基腐病水稻品种128和感病品种特籼13的活性氧与基腐病抗性有关。在接种后12h,O<,2><->和H<,2>O<,2>均增加,且在24h达到第一个高峰,品种128对病菌侵染反应快,植株体内O<,2><->和H<,2>O<,2>产生的量多,而特籼13对病菌侵染反应慢,植株体内O<,2><->和H<,2>O<,2>产生的量少。在接菌24h,品种128的SOD比活性高于特籼13,但48h后,其活性则低于特籼13。在CAT 活性方面,抗、感品种CAT变化规律相反。水稻接菌24h后的不同时间,抗病品种128的MDA含量均高于感病品种特籼13。
毒素是病原细菌重要的致病因子之一,本研究表明,水稻基腐病菌能产生毒素。通过多次的层析分离,获得了单一毒素组分T3,该组分为黄色固体,溶于甲醇、正丁醇、水和甲酸;不溶于三氯甲烷、乙酸乙酯;微溶于丙酮,是非糖类和非蛋白质类物质,对紫外线敏感,在酸性和空气中易分解。
生物活性试验表明,水稻基腐病菌毒素具有抑制水稻幼根生长、导致秧苗萎蔫、引起烟草细胞坏死、抑制植物病原细菌和诱导水稻防卫酶活性等生物学作用。高浓度毒素抑制水稻、玉米、番茄和烟草种子萌发,低浓度毒素则具有促进根、芽生长的作用。此外,毒素对来自5个属的10种植物病原细菌具有抑菌活性。用病菌毒素处理水稻品种128和特籼13,结果表明,毒素具有诱导水稻PAL和POD作用,且对抗病品种128的POD和PAL诱导活性均高于感病品种特籼13;毒素对叶片POD和PAL活性的诱导均早于对根的诱导。
采用病菌毒素注射烟草叶片后,导致烟草细胞中O<,2><->和NO的大量增加。电泳检测烟草DNA断裂成小片断且出现明显的弥散,没有细胞程序性死亡(PCD)的DNA梯特征。CAT、SOD、POD和PAL等酶活性总体呈上升水平,但H<,2>O<,2>含量则明显降低。进一步研究发现,活性氧的产生与Ca<2+>有关。由上述结果表明,毒素导致烟草细胞死亡,与产生大量的O<,2><->和NO的作用密切相关。利用化学诱变剂处理基腐病菌,获得了不产生毒素的突变菌株Ech7-4,验证了病菌对水稻根的抑制是由于毒素的作用。毒素突变体,对水稻种子萌发生根和幼苗的萎蔫均无作用,同时也不侵染水稻,表明不产生毒素的突变体对水稻没有致病力。进一步比较毒素突变体和野生菌产生5种胞外酶及马铃薯软腐试验,定性检测结果表明,两者没有差异。由此说明,毒素对水稻基腐病菌的致病性是至关重要的因子。
通过化学方法对细菌质粒的消除,获得了基腐病菌去质粒的突变体:Ech7-mul,生物活性测定结果表明,野生菌株及其质粒突变体均能产生毒素,由此认为,水稻基腐病菌毒素的生物合成是由染色体基因编码,而与质粒无关。从260条随机引物中,筛选到一条引物K10,能从毒素突变体中扩增出2139bp大小的 DNA 特异片段,将该片段克隆,测序分析,设计特异引物,在突变体中获得了与毒素产生相关的SCAR分子标记(标记符合率为100%)。该基因片段有5个ORF,其中两个ORF分别编码NADH-黄素还原酶和N—乙酰转移酶,另外两个不完整的ORF编码的蛋白分别与Pseudomonas aerginosa (ZP00136947)和Yersinia Pestis(ZP01177873)的抗菌素代谢转运蛋白通透酶(DMT)具有66%和46%的同源率。进一步根据2139bp DNA序列,设计不同引物组合扩增野生菌 Ech7,结果能将NADH-黄素还原酶和N—乙酰转移酶两个基因完整扩增出来,其基因序列与突变体菌株完全相同。但在野生菌中,采用本研究的一系列引物,未能扩增出2139 bp 3’端约600 bp大小的片段,推测毒素突变体基因突变的位点可能位于SCAR标记DNA的3’末端,有待于进一步研究。