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精子发生是一个复杂的生物学过程,整个过程中受许多特异分子及细胞间复杂而精密的调节,而睾丸未成熟支持细胞的增殖活性直接影响着成年动物生精能力。近年来,circRNA作为新兴的非编码RNA具有参与调控基因表达的功能。本研究基于前期研究基础,以circBTBD7作为ce RNA参与miR-222及miR-24-3p的调控为切入点,进一步拓展研究内容和方向,研究结果可为进一步揭示非编码RNA调控猪未成熟支持细胞生长发育的机理提供新的启示与理论依据。研究结果如下:（1）circBTBD7促进猪未成熟支持细胞增殖而抑制其凋亡基于前期RNA-seq的鉴定结果,筛选出源于BTBD7（BTB/POZ domain-containing protein 7）基因的circBTBD7,其位于猪基因组的chr7:121258975-121260967区域,包含2个外显子和1个内含子,总长1992 nt。为明确circBTBD7的功能,构建circBTBD7的p CE-RB-Mam-EGFP过表达载体并转染至猪未成熟支持细胞中,通过q RT-PCR、琼脂糖凝胶电泳和Sanger测序技术验证了其在猪未成熟支持细胞中能够成环且具有过表达的效果。采用流式细胞术检测细胞周期,q RT-PCR实验技术检测细胞周期相关基因（C-MYC、CNNE1、CNND1和CDK基因）及增殖相关基因（BMP、IGF、FGF、GDNF、PCNA和EGF）表达水平,CCK8和Ed U试剂盒检测细胞增殖情况,ATP试剂盒检测细胞ATP水平,Annexin V-FITC/PI染色试剂盒于流式细胞仪上检测细胞的凋亡情况,Western blot技术检测细胞凋亡相关基因（Bcl2、BAX和Caspase-3基因）表达情况。结果显示,过表达circBTBD7后,细胞的周期进程加快,相比对照组,其处于G1期的细胞明显的往S期和G2期移动,周期和增殖相关基因表达水平均有所提升,细胞增殖活性增强,ATP水平含量上升;细胞早期凋亡比例和晚期凋亡比例均显著下降,促凋亡相关基因BAX、Casepase-3的蛋白表达降低,而抑凋亡相关基因Bcl2的蛋白表达上升。（2）circBTBD7通过吸附miR-222调控猪睾丸未成熟支持细胞生长整合前期组学数据并利用RNA hybrid软件对circBTBD7和miR-222的结合位点进行在线预测,综合分析筛选出11个候选miRNA,分别为miR-222、miR-744、miR-425、miR-34a、miR-30c、miR-219a、miR-143-5p、miR-139-3p、miR-24-3p、miR-345-5p和miR-139-5p。团队前期的研究结果显示miR-222可参与调控猪睾丸未成熟支持细胞的生长,其研究发现是通过下调GRB10基因的表达使PI3K/AKT信号通路失活,从而抑制猪睾丸未成熟支持细胞的生长。因此,初步以miR-222为研究对象,探讨circBTBD7是否可作为竞争性内源RNA参与猪睾丸未成熟支持细胞的生长调控。采用circRNA-pull down及实时荧光定量PCR等试验技术确定miR-222能被circBTBD7吸附,且荧光原位杂交技术（Fluorescence In Situ Hybridization,FISH）实验结果表明circBTBD7在细胞质中的表达要高于细胞核,初步证明circBTBD7可能作为ce RNA在转录后水平调控基因表达。为进一步明确circBTBD7是否可通过吸附miR-222来调控猪睾丸未成熟支持细胞的生长,本研究设计了circBTBD7与miR-222的共转染实验,其转染组成分别设为A)circBTBD7-p CE-RB-Mam-EGFP载体+miRNA mimic、B)circBTBD7-p CE-RB-Mam-EGFP载体+mimic NC、C)空白-p CE-RB-Mam-EGFP载体+mimic NC,采用上述多种实验方法检测其对猪未成熟支持细胞的增殖和凋亡情况,并通过实时荧光定量PCR技术检测共转染处理的猪睾丸未成熟支持细胞内miR-222和GRB10基因各自的表达情况。结果表明,circBTBD7能部分挽救miR-222对细胞生物学功能的影响,其可能是通过增加下游靶基因GRB10的表达促使形成。（3）circBTBD7通过吸附miR-24-3p调控猪睾丸未成熟支持细胞生长在候选的11个miRNA中,circRNA-pull down实验结果显示miR-24-3p能大幅度的被circBTBD7吸附;为明确circBTBD7与miR-24-3p的靶向关系,首先根据circBTBD7与miR-24-3p的结合位点,构建双荧光素酶报告基因载体,分别与miRNA或NC共转染至猪睾丸未成熟支持细胞,检测两组的荧光活性;采用miRNA-pull down等技术进一步反向验证其结合关系,其试验证明circBTBD7能与miR-24-3p直接结合。为进一步明确circBTBD7通过吸附miR-24-3p调控猪睾丸未成熟支持细胞的生长情况,本研究设计了与miR-222同样的共转染实验,采用上述多种实验方法检测其对猪睾丸未成熟支持细胞的增殖和凋亡情况。结果表明,circBTBD7通过吸附miR-24-3p调控猪睾丸未成熟支持细胞生长。（4）miR-24-3p靶向调控MAPK7基因抑制猪睾丸未成熟支持细胞增殖而促进其凋亡为进一步探究miR-24-3p和m RNA的靶向关系以及调控机理。首先,整合miR-24-3p和m RNA组学数据以分析miR-24-3p和下游靶基因的表达水平关系,并使用Target Scan、mirtarbase、miRDB、miRWalk和RNAhybrid等在线软件预测miR-24-3p与靶基因的结合位点,综合靶基因参与KEGG信号通路分析筛选出MAPK7基因。为了确定miR-24-3p和MAPK7之间的调控关系,分别过表达和抑制表达miR-24-3p至猪睾丸未成熟支持细胞中,利用q RT-PCR和western blot技术检测靶基因MAPK7的m RNA和蛋白表达水平,且在miRNA-pull down的实验中,也可验证其纯化的RNA中是否存在MAPK7基因的表达,并采用上述多种实验方法检测其对猪睾丸未成熟支持细胞的增殖和凋亡情况。结果显示,过表达miR-24-3p后MAPK7基因的m RNA表达水平降低且蛋白水平表达也显著下降;同时野生型生物素-miR-24-3p转染的细胞所纯化出的RNA中MAPK7基因的表达显著高于突变型组。过表达miR-24-3p于猪睾丸未成熟支持细胞后,细胞生长受到抑制,细胞凋亡率显著提升,ATP相对含量下降;干扰MAPK7基因的实验结果与过表达miR-24-3p的结果一致,而抑制表达miR-24-3p后的结果与之相反。为进一步研究miR-24-3p与MAPK7基因在猪睾丸未成熟支持细胞中的作用机理,为此设计3组共转染实验,转染组成分别为A)miR-24-3p inhibitor+MAPK7 siRNA、B)miR-24-3p inhibitor+siRNA NC、C)inhibitor NC+siRNA NC,利用上述多种实验方法检测其对猪睾丸未成熟支持细胞的增殖和凋亡情况。结果显示,miR-24-3p inhibitor+siRNA NC组相比其他组而言,CCK8和Ed U增殖实验结果均显示细胞活性增强,流式细胞检测结果表明细胞周期进程加快,q RT-PCR验证其增殖基因表达水平均上升,细胞凋亡率降低,ATP相对含量升高,与抑制表达miR-24-3p作用一致;而转染miR-24-3p inhibitor+MAPK7 siRNA组结果与之相反。综上所述,circBTBD7可作为ce RNA参与调控猪睾丸未成熟支持细胞生长发育,通过吸附miR-222和miR-24-3p增强下游靶基因GRB10和MAPK7的表达,从而促进猪睾丸未成熟支持细胞增殖,抑制其凋亡。