前言缺氧诱导因子1(HIF-1)是细胞在缺氧条件上下产生的核蛋白,由α和β亚基组成。在缺氧条件下,细胞核产生HIF-1与靶基因结合,促进该基因转录,引起细胞对缺氧的一系列反应,在促进红细胞生成,血管生成,调节血管及促进糖酵解方面有重要作用。缺氧诱导因子1在缺氧条件下对心肌细胞同样发挥重要作用。缺血预适应(IP)作为心脏通过反复短暂的心肌缺血/再灌注而产生的一种自我保护机制,可以使HIF-1α的表达增加,对心肌细胞具有保护作用。鉴于缺血时HIF-1α的表达是引发各种缺氧应激蛋白表达的转录因子,在缺血的适应性反应中起核心作用,被认为是内源性保护机制的始动因子和共同途径,因而可以设想缺血预处理可能是通过HIF-1α表达及其促进下游相关基因的转录和表达来发挥保护效应的。缺氧诱导因子1对大鼠心肌梗死及再灌注损伤的作用以及信号传导通路尚不十分清楚。基于此,我们研究了HIF-1α对大鼠心肌梗死及再灌注损伤的作用以及PKC的信号传导作用,分为三个部分。第一部分心肌内注射HIF-1α进行基因转染对大鼠心肌梗死的影响目的缺氧诱导因子(HIF-1)是细胞在缺氧条件下产生的核蛋白。由α和β亚基组成。在缺氧条件下,细胞核产生HIF-1与靶基因结合,促进该基因转录,引起细胞对缺氧的一系列反应,在促进红细胞生成,血管生成,调节血管及促进糖酵解方面有重要作用。缺氧诱导因子1在缺氧条件下对心肌细胞同样发挥重要作用。缺血预处理(IP)可以使HIF-1α的表达增加,对心肌细胞具有保护作用。但转染HIF-1α是否对心肌梗死具有保护作用尚不十分清楚,本实验将对急性心肌梗死模型大鼠进行心肌内注射HIF-1α,观察HIF-1α对心肌梗死有何影响。材料与方法体重250-350克的雄性Wista大鼠72只,由中国医科大学附属盛京医院动物部提供。将实验分为三组,第一组为转染腺病毒HIF-1α的Ad-HIF-1α组;第二组为转染空质粒的Ad-null组(转染空质粒组);第三组为假手术组;每组以术后的不同时间处死取材分3天,7天,14天三个亚组,每个亚组8只。采用文献方法建立心肌梗死模型。Ad-HIF-1α组和Ad-null组在左室游离壁的三个不同部位分别注射50μg的Ad-HIF-1α和50μg的Ad-dull,然后关胸缝合。假手术组不结扎左前降支。转染3天、7天及14天后,10%/水合氯醛腹腔注射麻醉,经原切口下一肋间开胸,观察心脏活动形态后活体取出心脏,迅速取材,去除左、右心房及右心室,冲洗后4%多聚甲醛溶液固定,沿左室长轴由心尖至心底做厚切片,将左室分为6片,石蜡包埋切片,HE染色行形态学观察,14天后测量心肌梗死面积。CD34-抗显示毛细血管计算得毛细血管密度。逆转录聚合酶链法(RT-PCR)测定HIF-1αmRNA、VEGF mRNA表达,用VEGF试剂盒测定VEGF含量。结果1、心肌梗死2h后,梗死区心肌纤维断裂,细胞淡染,心肌梗死后3d,梗死区心肌纤维溶解断裂,细胞淡染,大量炎细胞浸润。心肌梗死后14d可见有明显结缔组织增生。2、心肌梗死面积测量:转染14天后,转染组心肌梗死面积(Ai/A)(23.85±2.25)%明显小于Ad-null组(38.74±3.12)%,有显著性差异P＜0.01。3、注射Ad-HIF-1α质粒3天后,心肌梗死区阳性的血管未见有明显增加,与注射Ad-null组相比P＞0.05;7天时心肌梗死区可见有大量的CD34染色阳性的血管,与注射Ad-null组相比有统计学意义,P＜0.01;14天时更加明显P＜0.01。4、血中VEGF含量在急性心肌梗死模型中,3d、7d升高,14d才恢复,而Ad-HIF-1α组比Ad-null组在3、7天升高更显著(P＜0.01)。5、转染腺病毒HIF-1α基因的心肌组织中第3天即可测出478 bp的HIF-1α及537bp VEGF部分转录产物,第7、14天检测仍有表达,其反应产物电泳后可见478bp及537bp条带,Ad—null组的心肌组织虽有表达,但相对于转染腺病毒HIF-1α的心肌组织表达明显较弱;而假手术组无明显表达。结论心肌内注射腺病毒HIF-1α,能增加HIF-1α和VEGFmRNA的基因表达;使血中VEGF水平升高;心肌毛细血管密度明显增加;使心肌梗死面积明显减少,对急性心肌梗死具有明显的保护作用。第二部分缺血预适应后急性心肌梗死HIF-1α表达及PKC的信号传导作用目的缺血预适应(IP)作为心脏通过反复短暂的心肌缺血/再灌注而产生的一种自我保护机制,对心脏的保护作用已为大家共识,Shiki等则在1987年首次证实预先5分钟的冠状动脉阻闭可明显降低在体大鼠心脏持续缺血后再灌注心律失常的发生率。虽然IP现象已得到大家的共识,但其确切机制尚不完全明了,细胞内信号转导途径也未完全阐明。鉴于缺血时HIF-1α的表达是引发各种缺氧应激蛋白表达的转录因子,在缺血的适应性反应中起核心作用,被认为是内源性保护机制的始动因子和共同途径,因而可以设想缺血预处理可能是通过HIF-1α表达及其促进下游相关基因的转录和表达来发挥保护效应的。而蛋白激酶C(PKC)的信号传导对缺血预适后急性心肌梗死HIF-1表达有何影响尚不十分清楚。基于此,我们研究了缺血预适应后急性心肌梗死HIF-1表达有何变化及PKC的信号传导作用。材料与方法体重250-350克的雄性Wista大鼠32只,由中国医科大学附属盛京医院动物部提供。将实验分为四组,第一组为缺血预适应组(IP组);第二组为单纯急性心肌梗死组(MI组);第三组为缺血预适应加KPC抑制剂组(IP+Ⅰ组);第四组为假手术组(C组)。采用文献方法建立心肌梗死模型。左前降支被结扎后建立心肌梗死模型,缺血预适应(IP)组结扎左前降支5分钟后松开套管,反复三次,然后结扎左前降支;缺血预适应加KPC抑制剂组(IP+Ⅰ组)预适应前10分钟静脉注射PKC抑制剂白屈菜季铵碱(chelerythrine 5mg/kgⅳ),然后结扎左前降支;假手术组(C)不结扎左前降支。1天后,10%/水合氯醛腹腔注射麻醉,经原切口下一肋间开胸,观察心脏活动形态后活体取出心脏,迅速取材,去除左、右心房及右心室,冲洗后4%多聚甲醛溶液固定,沿左室长轴由心尖至心底做厚切片,将左室分为6片,石蜡包埋切片。HE染色进行形态学观察,1天后测量心肌梗死面积。免疫组化染色(SP法)观察HIF-1α表达,逆转录聚合酶链法(RT-PCR)测定HIF-1αmRNA、VEGF mRNA表达,蛋白质印记分析检测HIF-1α、VEGF的蛋白表达,术前术后用VEGF试剂盒测定VEGF含量。结果1、心肌梗死1天后,梗死区心肌纤维溶解断裂,细胞淡染,大量炎细胞浸润。2、HIF-1αmRNA表达,IP组明显增加,比C组、MI组、IP+Ⅰ组有显著差异(P＜0.01),IP+Ⅰ组比MI组无显著差异(P＞0.05)。VEGFmRNA表达,IP组明显增加,比C组、MI组、IP+Ⅰ组有显著差异(P＜0.01),P+Ⅰ组比MI组无显著差异(P＞0.05)。其蛋白表达有相同的变化。缺血预适应基础上使用PKC抑制剂chelerythrine 5mg&gⅳ后,HIF-1αmRNA表达明显减少,有显著差异(P＜0.01),其靶基因VEGFmRNA也明显减少,其蛋白表达有相同的变化。3、IP组心肌梗死面积(Ai/A)(24.18±2.25)%明显小于IP+Ⅰ组(38.11±2.94)%和MI组(37.73±3.32)%,有显著性差异P＜0.01。结论1、缺血预适应能使HIF-1αmRNA表达明显增加,其靶基因VEGFmRNA也明显增加,其蛋白表达有相同的变化。2.HIF-1α表达是缺血预适应重要的内源性保护机制。3.HIF-1α的表达是依赖于PKC激活的,PKC是HIF-1α表达的重要信号传导通路。第三部分HIF-1α对大鼠心肌再灌注损伤的保护作用目的缺血-再灌注损伤(ischemia-reperfusion injury,IRI)是重要的临床现象。使用氧自由基清除剂、钙离子拮抗剂、β受体阻滞剂等对抗钙离子超载和氧自由基的措施对IRI的疗效令人失望。缺氧诱导因子(HIF-1α)是细胞在缺氧条件下产生的核转录因子。最近的实验表明,血红素加氧酶(HO-1)可以抑制IRI,而HO-1编码基因是HIF-1α重要的靶基因之一。二甲基乙二酰基甘氨酸(DMOG)是脯氨酸羟化酶(Prolylhydroxylase)的抑制剂,可以显著地增强HIF-1α的活性。在缺血与再灌注损伤中,白细胞介素8(IL-8)是重要的损伤因子,其水平同缺血-再灌注损伤程度呈正相关。本实验通过DMOG增强HIF-1α的活性,观察HIF-1α活性与HO-1基因表达、IL-8水平的变化,探讨HIF-1α对心肌缺血-再灌注损伤的影响。材料与方法选择体重在250～350g的雄性大鼠32只(12-14周龄)进行实验(实验动物由中国医科大学附属盛京医院动物室提供)。将实验分为四组,每组8只。第一组:为DMOG处理组,在缺血与再灌注损伤模型建立前24h进行腹腔内注射DMOG,剂量为20ug/g。第二组:为盐水注射组(saline组),在缺血与再灌注损伤模型建立前24h进行腹腔内注射生理盐水0.5ml。第三组:为缺血预适应(IP)组;第四组对照组,即假手术组。采用文献方法建立缺血与再灌注损伤模型,打开前胸暴露心脏(参阅第一部分),结扎左前降支(刚分出第一对角支处),30分钟后打开结扎,再灌注180分钟后迅速取出心脏。缺血预适应(IP)组结扎左前降支5分钟后松开套管,反复三次,然后结扎左前降支30分钟后打开结扎,再灌注180分钟后迅速取出心脏,去除左、右心房及右心室,冲洗后4%多聚甲醛溶液固定,沿左室长轴由心尖至心底做厚切片,将左室分为6片,石蜡包埋切片。假手术组(对照组)不结扎左前降支。180分钟后测量心肌梗死面积,逆转录聚合酶链法(RT-PCR)测定HIF-1αmRNA、HO-1 mRNA表达,蛋白质印记分析测定HIF-1α、HO-1及Caspase-3的蛋白表达的蛋白表达,再灌注60分、120分采用大鼠眶静脉采血0.5ml,再灌注180分用大鼠心内采血,ELLSA试剂盒测定IL-8水平;MPO(髓过氧化物酶)试剂盒测定MPO水平。结果心肌缺血与再灌注180分后,梗死区心肌纤维溶解断裂,细胞淡染,炎细胞浸润,心肌缺血与再灌注180分后DMOG组、IP组的HIF-1αmRNA、HO-1 mRNA表达比saline组明显增加,P＜0.01:其蛋白表达有相同的变化。再灌注180分钟后,DMOG处理组心肌梗死面积为(23.56±2.12)%,saline组的心肌梗死面积为(35.21±2.34)%,DMOG处理组的心肌梗死面积较saline组明显减少(P＜0.01);IP组的心肌梗死面积为(21.56±2.27)%较saline组明显减少(P＜0.01);DMOG组、IP组的Caspase-3蛋白表达比saline组明显减少,P＜0.01;再灌注180分钟后,DMOG处理组的IL-8的水平为(456±39)pg/ml,saline组的IL-8的水平为(812±26)pg/ml,DMOG处理组较saline组明显减少(P＜0.01);120分钟、180分钟后,DMOG组与IP组的MPO水平较saline组明显减少。结论经DMOG处理后,HIF-1αmRNA、HO-1mRNA表达明显增多,心肌梗死面积明显减少,Caspase-3的活性与IL-8的水平明显降低,引起了类似延迟缺血预适应的现象,表明HIF-1α对心肌缺血与再灌注损伤具有重要保护作用。