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小麦茎基腐病(wheat crown rot)是一种由多种病原菌引起的土传真菌病害，近年在我国黄淮麦区严重发生，对小麦安全生产构成严重威胁。假禾谷镰孢(Fusarium pseudograminearum)是我国黄淮麦区小麦茎基腐病的优势病原菌，目前针对假禾谷镰孢引起的小麦茎基腐病的生物防治相关研究报道较少，亟需筛选对假禾谷镰孢具有较高利用价值的生防资源，并研究其与病原菌的互作机制，为小麦茎基腐病的绿色防控提供理论依据。基于此，本文开展了以下研究:
1.小麦茎基腐病生防细菌的分离和筛选。从河南省不同地区的小麦茎基腐病田中采集10份小麦根际土壤样品，通过稀释涂布法分离得到98株细菌。平板对峙试验初筛结果表明，分离所得细菌中共有27株对假禾谷镰孢表现出较好的皿内拮抗效果。室内盆栽试验复筛结果表明，初筛所得菌株中共有14株对小麦茎基腐病具有良好的盆栽防效，其中菌株YB-161的防效达68.15％，并对小麦植株具有较好的促生作用。抑菌谱测定结果表明，菌株YB-161对辣椒炭疽病菌(Colletotrichum acutatum)、烟草疫霉病菌(Phytophthora parasitica)等5种植物病原菌均有明显的拮抗作用。综合各试验结果，筛选生防细菌YB-161进行后续研究。
2.生防细菌YB-161的鉴定和抑菌能力测定。菌株YB-161菌落表面粗糙，边缘不规则，呈乳白色不透明状;电镜下菌体形态为杆状，两端钝圆;革兰氏染色阳性，芽孢中生至近顶生。Biolog微生物自动鉴定系统结果显示，菌株YB-161与数据库中解淀粉芽孢杆菌的相似值最高。gyrA序列分析结果表明，菌株YB-161与解淀粉芽孢杆菌序列的同源性最高。综合上述试验结果，将菌株YB-161鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。菌株YB-161发酵滤液可使假禾谷镰孢菌落缩小、变黄、边缘畸形，其5倍稀释液和10倍稀释液对假禾谷镰孢的菌落抑制率分别达到66.67％和44.33％。显微观察发现，菌株YB-161发酵滤液可使假禾谷镰孢菌丝出现明显的膨大、断裂等畸形现象，表明YB-161对假禾谷镰孢菌丝的生长具有明显的拮抗活性。
3.生防细菌YB-161对小麦茎基腐病的田间防效测定。2019年3月2日和5月4日的田间调查结果显示，YB-161菌液拌种处理的病情指数分别为6.27和8.47，显著低于空白对照，对小麦茎基腐病的防治效果分别达到58.33％和52.35％，与化学药剂4.8％苯醚·咯菌腈悬浮种衣剂的防效相当。测产结果显示，YB-161菌液拌种处理产量为9046.37kg/hm2，增产率达6.63％，表明生防细菌YB-161能有效防治小麦茎基腐病，具有较好的开发潜力。
4.假禾谷镰孢在生防细菌YB-161胁迫下的转录组学分析。与生防细菌YB-161共培养条件下假禾谷镰孢的转录组测序结果显示:(1)4h样品中2394个基因差异表达显著，其中1524个基因显著上调表达，870个基因显著下调表达;16h样品中4174个基因差异表达显著，其中2130个基因显著上调表达，2044个基因显著下调表达。(2)GO功能注释表明:4h和16h样品的差异表达基因主要集中在代谢过程、细胞过程、细胞膜等方面。(3)KEGG功能注释表明:4h样品上调表达基因，主要富集在氨酰生物合成、类固醇生物合成等通路;4h样品下调表达基因，主要富集在核糖体、柠檬酸循环丙酮酸代谢等通路。16h样品上调表达基因，主要集中在核糖体合成、氨酰生物合成等通路。16h样品下调表达基因中，主要集中在柠檬酸循环、甘油酯代谢等通路。结果表明假禾谷镰孢在生防细菌YB-161胁迫下基因差异表达明显，为研究菌株YB-161与假禾谷镰孢的互作机制奠定了基础。
5.生防细菌YB-161胁迫下假禾谷镰孢细胞凋亡相关基因FpTatD4的表达分析及其生物学功能研究。转录组测序和RT-qPCR结果表明，假禾谷镰孢FPSE_05373基因在生防细菌YB-161处理4h和16h后均显著上调表达。对该基因编码氨基酸进行同源性比对分析，发现其与细胞凋亡相关基因TatD4同源，将其鉴定为FpTatD4。基于spilt-marker同源置换的基因敲除策略，采用PEG介导的原生质体转化法，获得FpTatD4基因敲除突变体△fptatd4。将去掉终止密码子的FpTatD4及其上游的启动子序列构建pKNTG载体，导入△fptatd4获得回补菌株fptatd4C。与野生型和回补菌株相比，△fptatd4菌落生长、对多种胁迫的耐受性、致病性以及对生防细菌YB-161的敏感性无明显变化，但分生孢子产量显著降低。结果表明FpTatD4与假禾谷镰孢分生孢子的形成有关。
本研究丰富了小麦茎基腐病的生防资源，探索了假禾谷镰孢对解淀粉芽孢杆菌胁迫的应答机制，初步解析了菌株YB-161胁迫条件下假禾谷镰孢细胞凋亡基因FpTatD4的表达模式及其生物学功能，为小麦茎基腐病的绿色防控提供理论基础。
1.小麦茎基腐病生防细菌的分离和筛选。从河南省不同地区的小麦茎基腐病田中采集10份小麦根际土壤样品，通过稀释涂布法分离得到98株细菌。平板对峙试验初筛结果表明，分离所得细菌中共有27株对假禾谷镰孢表现出较好的皿内拮抗效果。室内盆栽试验复筛结果表明，初筛所得菌株中共有14株对小麦茎基腐病具有良好的盆栽防效，其中菌株YB-161的防效达68.15％，并对小麦植株具有较好的促生作用。抑菌谱测定结果表明，菌株YB-161对辣椒炭疽病菌(Colletotrichum acutatum)、烟草疫霉病菌(Phytophthora parasitica)等5种植物病原菌均有明显的拮抗作用。综合各试验结果，筛选生防细菌YB-161进行后续研究。
2.生防细菌YB-161的鉴定和抑菌能力测定。菌株YB-161菌落表面粗糙，边缘不规则，呈乳白色不透明状;电镜下菌体形态为杆状，两端钝圆;革兰氏染色阳性，芽孢中生至近顶生。Biolog微生物自动鉴定系统结果显示，菌株YB-161与数据库中解淀粉芽孢杆菌的相似值最高。gyrA序列分析结果表明，菌株YB-161与解淀粉芽孢杆菌序列的同源性最高。综合上述试验结果，将菌株YB-161鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。菌株YB-161发酵滤液可使假禾谷镰孢菌落缩小、变黄、边缘畸形，其5倍稀释液和10倍稀释液对假禾谷镰孢的菌落抑制率分别达到66.67％和44.33％。显微观察发现，菌株YB-161发酵滤液可使假禾谷镰孢菌丝出现明显的膨大、断裂等畸形现象，表明YB-161对假禾谷镰孢菌丝的生长具有明显的拮抗活性。
3.生防细菌YB-161对小麦茎基腐病的田间防效测定。2019年3月2日和5月4日的田间调查结果显示，YB-161菌液拌种处理的病情指数分别为6.27和8.47，显著低于空白对照，对小麦茎基腐病的防治效果分别达到58.33％和52.35％，与化学药剂4.8％苯醚·咯菌腈悬浮种衣剂的防效相当。测产结果显示，YB-161菌液拌种处理产量为9046.37kg/hm2，增产率达6.63％，表明生防细菌YB-161能有效防治小麦茎基腐病，具有较好的开发潜力。
4.假禾谷镰孢在生防细菌YB-161胁迫下的转录组学分析。与生防细菌YB-161共培养条件下假禾谷镰孢的转录组测序结果显示:(1)4h样品中2394个基因差异表达显著，其中1524个基因显著上调表达，870个基因显著下调表达;16h样品中4174个基因差异表达显著，其中2130个基因显著上调表达，2044个基因显著下调表达。(2)GO功能注释表明:4h和16h样品的差异表达基因主要集中在代谢过程、细胞过程、细胞膜等方面。(3)KEGG功能注释表明:4h样品上调表达基因，主要富集在氨酰生物合成、类固醇生物合成等通路;4h样品下调表达基因，主要富集在核糖体、柠檬酸循环丙酮酸代谢等通路。16h样品上调表达基因，主要集中在核糖体合成、氨酰生物合成等通路。16h样品下调表达基因中，主要集中在柠檬酸循环、甘油酯代谢等通路。结果表明假禾谷镰孢在生防细菌YB-161胁迫下基因差异表达明显，为研究菌株YB-161与假禾谷镰孢的互作机制奠定了基础。
5.生防细菌YB-161胁迫下假禾谷镰孢细胞凋亡相关基因FpTatD4的表达分析及其生物学功能研究。转录组测序和RT-qPCR结果表明，假禾谷镰孢FPSE_05373基因在生防细菌YB-161处理4h和16h后均显著上调表达。对该基因编码氨基酸进行同源性比对分析，发现其与细胞凋亡相关基因TatD4同源，将其鉴定为FpTatD4。基于spilt-marker同源置换的基因敲除策略，采用PEG介导的原生质体转化法，获得FpTatD4基因敲除突变体△fptatd4。将去掉终止密码子的FpTatD4及其上游的启动子序列构建pKNTG载体，导入△fptatd4获得回补菌株fptatd4C。与野生型和回补菌株相比，△fptatd4菌落生长、对多种胁迫的耐受性、致病性以及对生防细菌YB-161的敏感性无明显变化，但分生孢子产量显著降低。结果表明FpTatD4与假禾谷镰孢分生孢子的形成有关。
本研究丰富了小麦茎基腐病的生防资源，探索了假禾谷镰孢对解淀粉芽孢杆菌胁迫的应答机制，初步解析了菌株YB-161胁迫条件下假禾谷镰孢细胞凋亡基因FpTatD4的表达模式及其生物学功能，为小麦茎基腐病的绿色防控提供理论基础。