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目的:研究证实α-黑素细胞刺激素(a-melanocyte-stimulating hormone,α-MSH)具有抗炎及免疫调节作用。本研究通过观察α-MSH对实验性变态反应性脑脊髓炎模型(experimental allergic encephalo- myelitis,EAE)发病情况、病理改变、外周血CD4+T细胞中CD4~+CD25~+FoxP3~+Treg和Th17细胞所占比例、相关细胞因子的影响,探讨α-MSH对EAE的发病有无保护作用及可能的免疫学机制,为临床治疗多发性硬化(multiple sclerosis,MS)寻求新的药物。方法:将40只雌性豚鼠随机分成4组:正常对照组、EAE对照组、EAE低剂量治疗组和EAE高剂量治疗组,每组各10只。自造模前7天开始,EAE低剂量治疗组每日腹腔注射α-MSH(0.25mg/kg.d),EAE高剂量治疗组每日腹腔注射α-MSH(1mg/kg.d),EAE对照组同时腹腔注射等体积磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffered solution,PBS)液;正常对照组同时腹腔注射等体积生理盐水。7天后开始造模,采用全脊髓匀浆(whole spinal cord homogenate,WSCH)抗原注入EAE对照组、EAE高及低剂量治疗组豚鼠双后足掌皮下及颈部皮下,每个点0.2ml,正常对照组注射等量生理盐水。造模后高、低剂量治疗组豚鼠按造模前的方法继续皮下注射α-MSH予以保护,EAE对照组及正常对照组分别同时腹腔注射等体积PBS液和生理盐水,直至整个实验结束。EAE对照组、EAE低剂量治疗组和EAE高剂量治疗组连续3天症状评分无加重或四肢瘫痪、死亡时作为EAE发病高峰期。记录发病豚鼠的潜伏期、进展期和高峰期神经功能障碍评分;于发病高峰期处死豚鼠,未发病的观察8周后处死,正常对照组8周后处死,留取豚鼠脑及脊髓组织,经处理切片行HE染色,光学显微镜下观察病理变化;留取各组豚鼠眶静脉血,用流式细胞仪检测外周血CD4+T细胞中CD4~+CD25~+FoxP3~+Treg和Th17细胞所占比例,用酶联免疫吸附(enzyme-labeled immunosorbent assay,ELISA)法检测外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)分泌干扰素-γ(interferon-γ,IFN-γ)、白细胞介素-4(interleukin-4,IL-4)、白细胞介素-17(interleukin-17,IL-17)、白细胞介素-23(interleukin-23,IL-23)的能力。结果:(1)豚鼠发病情况:正常对照组豚鼠未发病。EAE高、低剂量治疗组虽均有发病,但潜伏期相对较长,神经功能障碍程度也相对较轻。EAE对照组发病潜伏期为(10.8±1.6)天,EAE低剂量治疗组潜伏期(13.4±1.7天)较EAE对照组延长(P<0.05),EAE高剂量治疗组潜伏期(17.0±1.3天)较EAE对照组及EAE低剂量组均明显延长(P<0.01,P<0.01);EAE对照组发病进展期为(5.9±0.9)天,EAE低剂量治疗组进展期(4.1±1.1天)较EAE对照组缩短(P<0.05),EAE高剂量治疗组进展期(3.5±0.7天)较EAE对照组明显缩短(P<0.01),但同EAE低剂量治疗组比较没有统计学意义(P>0.05);EAE对照组发病高峰期神经功能障碍评分为(3.4±0.6)分,EAE低剂量治疗组神经功能障碍评分(2.7±0.7分)较EAE对照组降低(P<0.05),EAE高剂量治疗组神经功能障碍评分(2.1±0.6分)较EAE对照组及EAE低剂量组均明显降低(P<0.01,P<0.05)。(2)脑及脊髓病理变化:正常对照组豚鼠脑和脊髓无异常。EAE对照组豚鼠高峰期可见脑及脊髓实质内小血管充血,血管周围主要是小静脉周围有大量炎性细胞浸润,主要为单个核细胞浸润,形成“袖套”状改变,血管周围白质明显脱髓鞘改变。而治疗组病理改变较轻,高剂量治疗组最轻。(3)各组豚鼠外周血外周血CD4+T细胞中CD4~+CD25~+FoxP3~+Treg所占比例:正常对照组外周血CD4~+CD25~+FoxP3~+Treg细胞的比例为(5.81±0.28%),EAE对照组的比例(4.21±0.57%)较正常对照组明显下降(P<0.01),EAE低、高剂量治疗组的比例分别为(4.64±0.41%、5.52±0.44%),均较EAE对照组显著升高(P<0.05,P<0.01),高剂量治疗组较低剂量治疗组升高更明显(P<0.05)。(4)各组豚鼠外周血CD4+T细胞中Th17细胞所占比例:正常对照组外周血Th17细胞的比例为(1.39±0.48%),EAE对照组的比例(2.63±0.44%)较正常对照组明显增高(P<0.01),EAE低、高剂量治疗组的比例分别为(1.97±0.89%、1.42±0.66%),均较EAE对照组显著降低(P<0.05,P<0.01),高剂量治疗组较低剂量治疗组降低更明显(P<0.05)。(5)各组豚鼠外周血PBMC分泌IFN-γ、IL-4、IL-17、IL-23能力:EAE对照组豚鼠发病高峰期PBMC分泌IFN-γ、IL-17、IL-23能力较正常对照组升高(P<0.01,P<0.01,P<0.01),分泌IL-4能力较正常对照组降低(P<0.01);α-MSH高、低剂量治疗组豚鼠PBMC分泌IFN-γ、IL-17、IL-23能力较EAE对照组降低(P均<0.01),分泌IL-4能力较EAE对照组升高(P<0.01,P<0.01);α-MSH高剂量治疗组较低剂量治疗组分泌IFN-γ、IL-17、IL-23能力低(P<0.05,P<0.05,P<0.05),分泌IL-4能力较高(P<0.05,P<0.05,P<0.05)(。6)各组豚鼠外周血IFN-γ/IL-4比值:EAE对照组IFN-γ/IL-4比值较正常对照组明显升高(P<0.01),EAE低、高剂量治疗组IFN-γ/IL-4比值均较EAE对照组显著下降(P<0.01,P<0.01),高剂量治疗组下降更明显(P<0.05)。(7)相关性分析:EAE对照组及EAE各治疗组外周血Th17细胞比例、PBMC分泌IL-17能力、分泌IFN-γ能力、分泌IL-23能力、Th1/Th2细胞比值与EAE发病的潜伏期呈负相关(P<0.05),与进展期和发病高峰期神经功能障碍评分呈正相关(P<0.05);而外周血CD4~+CD25~+FoxP3~+Treg比例、PBMC分泌IL-4能力与潜伏期呈正相关(P<0.05),与进展期及发病高峰期神经功能障碍评分呈负相关(P<0.05);各组豚鼠外周血CD4~+CD25~+FoxP3~+Treg比例与Th17细胞比例呈负相关(P<0.05);各组豚鼠外周血PBMC分泌IL-17、IL-23能力与Th1/Th2细胞比值呈正相关(P<0.01)。结论:(1)采用多点皮下单次注射WSCH建立EAE模型,EAE豚鼠神经功能障碍症状明显,脑和脊髓血管周围炎性细胞浸润、白质脱髓鞘,说明此法造模成功,可重复性好。(2)EAE豚鼠体内存在着免疫失衡。EAE对照组豚鼠发病高峰期体内Th1型细胞因子IFN-γ增多,Th2型细胞因子IL-4减少,Th1/Th2细胞比例失衡,免疫格局向Th1型漂移;EAE对照组豚鼠Th17细胞比例及Th17型细胞因子IL-17、IL-23增多;相反CD4~+CD25~+FoxP3~+Treg比例下降,CD4~+CD25~+FoxP3~+Treg /Th17免疫格局向Th17细胞一侧漂移。(3)Th17细胞与Th1细胞在发挥效应的过程中存在合作或协同关系;CD4~+CD25~+FoxP3~+Treg细胞与Th17细胞在功能上相互拮抗,分化上相互联系,二者通过不同的细胞因子影响Th1/Th2细胞间平衡;相反Th1和Th2亦通过细胞因子的分泌影响着CD4~+CD25~+FoxP3~+ Treg/Th17细胞平衡。(4)α-MSH对EAE豚鼠发病具有保护作用:α-MSH能延长EAE发病潜伏期、缩短EAE发病进展期、减轻EAE豚鼠神经功能障碍,α-MSH对EAE发病的保护作用大小与剂量有关,高剂量作用更明显。(5)α-MSH对EAE豚鼠发病的防护作用机制:可能是通过分泌细胞因子调节Th1/Th2及CD4~+CD25~+FoxP3~+ Treg/Th17细胞比例失衡而发挥其免疫抑制功能的。