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华首线虫(Kalicephalus spp.)是显首科(Diaphanocephalidae)的寄生线虫,呈世界性分布。华首线虫主要感染蛇类,导致蛇食欲不振、消化机能减退、消瘦、代谢紊乱,给养蛇业造成严重的经济损失。常用的线虫种类鉴定方法主要依赖于传统的形态学特征,然而一些形态相似的成虫、虫卵和幼虫很难通过形态特征进行区分。核糖体内转录间隔区(Internal transcribed spacers,ITS rDNA)与线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)序列常被认为是良好的遗传标记,适用于研究寄生虫分子分类及系统进化关系。然而,目前对于华首线虫线粒体基因组的研究较少,仅对一未定种华首线虫属(Kalicephalus sp.)coxl(细胞色素c氧化酶第Ⅰ亚基)的部分序列作了初步研究,关于华首线虫线粒体基因组全序列信息仍未清楚,故开展华首线虫线粒体基因组分析是十分必要的,这对研究华首线虫的遗传进化、分子分类以及抗华首线虫药物的研制均有帮助。本研究对采自我国湖南省长沙市长沙县榔梨镇的21个样品,提取虫体基因组DNA,然后采用PCR方法扩增ITS rDNA目的基因,并对所得的阳性产物序列进行测定和分析。结果显示:经PCR扩增后可得到目的基因,其长度为695bp,包括了ITS-1 rDNA、5.8S rDNA和ITS-2 rDNA。经过序列比对分析,在21个样品中有20个为印度华首线虫(K.indicu)s,1个为短首华首线虫(K.branchycephlus)。其中印度华首线虫的ITS(ITS-1 rDNA和ITS-2 rDNA)总的A+T含量为52.64%～53.83%,短首华首线虫的ITS总的A+T含量是53.25%。在20个样品中印度华首线虫ITS基因序列的相似度为98.64%～100%,ITS-1及ITS-2的序列相似性分别为99.18%～100%及97.29%～100%,但5.8S rDNA却高度保守,相似度均为100%。在种间关系方面,印度华首线虫与短首华首线虫的ITS、ITS-1及ITS-2序列的种间差异分别为13.3%-14.8%、9.6%-11.6%和22.9%-26.3%。由此可见,华首线虫属ITS rDNA序列在种内是较为保守的,而种间差异较大,故ITS序列可作为华首线虫属分类鉴定的遗传标记分子。对上述印度华首线虫和短首华首线虫的虫体基因组DNA,采用PCR方法扩增线粒体基因组中的四个基因,即cox1、核糖体RNA小亚基(12S)、ATP酶第Ⅵ亚基(atp6)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶第Ⅳ亚基(nad4),对所得序列进行测序和序列分析。对其中7条印度华首线虫的cox1、12S、atp6、nad4序列作顺序拼接,然后采用贝叶斯分析(Bayesian Inference,BI)研究种系发育关系。结果显示:PCR扩增出cox1、12S、atp6和nad4基因序列,它们长度分别为400 bp、600 bp、500 bp和400 bp。序列分析发现,印度华首线虫的cox1基因变异度为0～4.23%,12S:0～3.57%;atp6:0.67%～8.67%;nad4:0%～11.01%,与短首华首线虫相比较,在种间差异度分别为 11.1%-12%,cox1;10.6%-11.8%,12S;0.9%-8.9%,atp6;0-13.2%,nad4)。遗传进化树分析结果发现,所得出7个印度华首线虫均处于同一分支,并且与锡兰钩口线虫(Ancylostomaceylanicum)在遗传距离上最为接近。采用PCR方法对上述印度华首线虫和短首华首线虫线粒体基因组进行扩增,并通过引物移步法测定其完整线粒体基因组序列,并对它们序列进行测定和遗传进化树分析。测序结果显示印度华首线虫线粒体基因组长度为13,588 bp,短首华首线虫为13,572 bp。它们的线粒体基因组序列均包含12个编码蛋白的基因,22个tRNA基因以及2个rRNA基因,但缺乏atp8基因。它们线粒体基因组排列及转录方向与钩口科的锡兰钩口线虫相同。对12个编码蛋白基因系统发育进化分析显示,显首科的印度华首线虫和短首华首线虫可聚类在一起,与其它线虫分别处于不同分枝,与锡兰钩口线虫所代表的钩口科较为接近。综上所述,本研究在国际上首次完成了显首科的印度华首线虫和短首华首线虫的mtDNA全序列测定,并研究了它们的四个线粒体基因片段(cox1、12S、atp6、nad4)的序列多态性。本研究结果不仅丰富了线虫线粒体基因组的数据,也为进一步研究爬行动物的寄生线虫分子分类学及种群遗传学提供了新的遗传标记。