论文部分内容阅读
超高压(HPP)辅助冻结技术是指将HPP施加于浸渍冷冻过程(IF)的一项新型食品速冻技术。目前,超高压冷冻(HPF)通过压力改变水的相变,调控冰晶形成路径(包括压力辅助冷冻PAF与压力转变冷冻PSF等类型),形成细小且均匀分布的胞内冰晶巨大优势已被证实且相关作用机理非常明确,然而HPF作用下食品蛋白质变性现象与作用机制仍不清晰。这是因为HPF冻结过程中同时涉及压力因素(Pressure-Factors,压力、时间)和冷冻因素(Freezing-Factors,温度、相变、重结晶、冰晶类型),导致变性情况相当复杂。本文以刀额新对虾以及其主要蛋白成分(以虾蛋白主要成分的肌动球蛋白(NAM)及对“黑变”起主导作用的多酚氧化酶(PPO)为代表)为研究对象,以压力和冷冻为作用因素,进行了压力和冷冻因素不同作用模式下对虾蛋白质变性的研究,主要包括压力和冷冻同时协同模式(HPF,包括100,150,300,400,500MPaP-20℃/30min(PAF)和200MPaP-20℃/30min(PSF))、压力和冷冻分阶段协同模式(HPP-IF,100-500MPa 0.1MPa P4℃/25min--20℃30min)下NAM、PPO的变性现象及冻结过程中压力因素、冷冻因素在蛋白质变性中的作用机制;并且以常规超高压(HPP,100-500MPaP4℃/25min)、常压浸渍冷冻(IF,0.1MPaP-20℃/30min)作对比。具体研究结果如下:(1)超高压冷冻对刀额新对虾物理及生化特性的影响冰晶形态及分布(细小均匀性)、保水性、自由水(T21)以及不易流动水(T22)比例降低程度的变化的差异显著性符合PSF(200MPaP-20℃/50min)>>PAF(100,150,200,300,400,500MPap-20℃/50min)>>IF(0.10MPP-20℃/50min);其中PAF各组之间的差异显著性主要是由压力的增大而变化加剧;肌肉质构及蛋白质DSC焓热变化随压力增加而表现出硬度及弹性增加、焓热值降低的趋势;300MPa为HPF处理下虾肉相关品质以及虾头/壳色泽加剧变化的起始点。压力辅助冷冻调控结晶途径可有效改善冻品对虾的组织微观及生化特性的品质:冰晶形态及分布决定虾肉微观组织、保水性、质构以及自由水、不易流动水的含量;当冰晶特性之间差异不显著时,压力-冷冻诱导的蛋白质变性是决定这些变化的主要因素。(2)超高压冷冻对肌动球蛋白宏观及构象的影响HPF(100-500MPaP-20℃/30min)、IF(0.1MPaP-20℃/30min)对NAM功能及结构的变化具有显著影响:NAM的溶解度、Ca2+-ATPase活性和T-SH含量、a-螺旋含量显著下降,表观疏水性以及荧光色谱的强度显著上升;且相关程度可排序为,未处理≤200MPap-20℃/30min。(PSF)<100,150MPaP-20℃/30min(PAF)<0.1MPaP-20℃/30min(IF)≤ 300MPa P-20℃/30min(PAF)<400,500MPa P-20℃/30min(PAF);SDS-PAGE条带显示无非二硫键以外的新共价键生成。结果表明:300 MPa是HPF诱导NAM变性的关键压力点;压力因素、冷冻因素分别是高压(300-500 MPa)HPF、低压HPF(100-200 MPa)诱导NAM变性过程中的主导因素;且后者在HPF(100-500 MPa)处理过程中可减弱前者对NAM变性的影响;二级、三级结构的改变主要发生在冰晶形成及生长阶段,即B → D(PSF)以及B → C→D(PAF)时期。(3)超高压冷冻对多酚氧化酶热力学特性及构象的影响0.1-500MPaP-20℃/30min处理对PPO活性的影响可分为两大类:IF(0.1MPa)、低压(100-200MPa)HPF处理基本无影响;高压(300-500MPa)HPF处理具有一定激发作用。然而,HPF以及IF处理(0.1-500 MPa)之后PPO的热力学特性参数和三级结构皆发生显著性变化。研究结果显示:300 MPa是HPF诱导PPO变性的转折压力点;HPF处理加强了 PPO的热稳定性;相同活性的PPO,可能具有不同的热力学表现及不同的构象;Pressure-Factors是HPF作用于PPO变性中的主要作用因素;HPF处理的PPO可能处于一种部分折叠的中间过渡态。(4)压力及冷冻分阶段协同对肌动球蛋白变性的影响HPP、IF、HPP-IF皆会显著影响NAM的宏观表现(溶解度及Ca2+-ATPase),100-200MPaP4℃/25min(HPP)<0.1MPaP-20℃/30min(IF)<100-200MPa 0.1MPaP4℃/25min--20℃/30min(HPP-IF);而升高压力,300-500 MPa,IF<HPP<HPP-IF;300MPa可被认为是压力因素介入NAM变性作用时的关键压力点。HPP-IF各处理组间呈现出随压力的增大而变性加剧的现象,且冷冻增大了HPP前处理之间的差异显著性。HPP-IF作用下NAM的T-SH、α-螺旋、SoANS、Trp的荧光发射强度都发生显著性改变;前两者呈现降低的趋势,后两者呈现增加的趋势;前者降低的程度较后者增加的程度弱,NAM的变性主要是由于疏水作用力导致的,其三级结构变化显著。(5)压力及冷冻分阶段协同对多酚氧化酶变性的影响低压(100-200 MPa)HPP-IF以及HPP、IF处理对PPO活性无显著性影响;高压(300-500 MPa)HPP-IF以及HPP处理促使PPO发生激活现象,且激活程度随压力的增大而增大,且可排序为HPP>HPP-IF。因此,300 MPa是PPO活性显著增加的关键点;HPP-IF中的IF阶段,可能使得HPP阶段产生的变性发生部分可逆性回转。HPP-IF、HPP、IF作用下PPO的三级荧光强度皆发生显著下降;PPO的荧光色谱和AFM图像显示相同活性的PPO可能存在不同的构象以及分子形式;且这种变化在HPP-IF冻结过程中的前(HPP)后(IF)阶段皆有发生。