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离子注入生物效应的发现,为生物的遗传改良开辟了新途径。本文通过N+离子注入诱变E.coli BL21,利用甲氧苄啶浓缩富集营养缺陷型菌,并结合平板影印法和平板点样法筛选得到胸腺嘧啶营养缺陷型(T-)菌株。
使用注入剂量为20×2.5×1013ions.cm-2,菌样的存活率为25%左右,以此剂量为最佳诱变剂量。诱变后的大肠杆菌在含有50μg的甲氧苄啶的培养基中进行浓缩,并进一步筛选得到一株胸腺嘧啶缺陷型的大肠杆菌NT0109。经分析,NT0109在基本培养基中需额外添加胸腺嘧啶才可以生长,该菌株胸苷酸从头合成途径应该失效,但补救途径还保留活性。
将胸苷酸从头合成途径中关键酶--胸苷酸合成酶(TSase)基因进行体外扩增,并连接到T载体上,经测序发现,突变株NT0109中ThyA基因的第173位碱基由腺嘌呤突变为胞嘧啶。通过对TSase变异前后三级结构比对分析,证实了正是TSase活性位点谷氨酸(E58)突变为丙氨酸(A58)以及相对应的另一活性位点苯丙氨酸(F176)侧链苯环结构的位移在很大程度上使得酶丧失了活性。
为确定是否由于TSase变异导致胸腺嘧啶缺陷型,将带有正常ThyA基因的重组表达质粒pET-28a-thyA转化至E.coli BL21中,构建出E.coli BL21 pET-28a-thyA重组菌(BT),能够在IPTG的诱导下大量的表达TS酶蛋白,表明了成功的构建出表达质粒pET-28a-thyA;将pET-28a-thyA转化至NT0109中,得到重组菌BT0,BT0营养要求在表型上与野生型相同,由此证明NT0109是由于TSase突变导致。