论文部分内容阅读
本文观察了肝脏卵圆细胞(HOC)在DMN大鼠肝硬化形成、消减过程中的变化及中医益气、养阴及清热利湿方剂对HOC增殖、分化的影响，探讨了其科学意义。
材料与方法：用二甲基亚硝胺(DMN)制备大鼠肝硬化模型；分别于DMN腹腔注射造模后3d、2w、4w及模型6w、8w随机处死模型大鼠6只，正常大鼠3只进行动态观察。于造模4w后终止毒物刺激，随机分为模型对照组和药物治疗组，药物治疗经口灌胃给予不同功效的中药方剂(黄芪汤、一贯煎、茵陈蒿汤和虫草菌丝)的流浸膏，模型对照组给予等量生理盐水。治疗2周后杀鼠取材。观测内容包括大鼠肝功能，肝组织羟脯氨酸含量，组织病理学，免疫组织化学检测肝组织α-SMA、MMP-9、MMP-13、Thy1.1、HGF、TGFβ1和SCF，蛋白免疫印记检测肝组织α-SMA、MMP-9、MMP-13、Thy1.1、HGF、TGFβ1和SCF，双重荧光免疫共聚焦激光扫描显微镜技术(DICLSM)检测肝组织AFP、CK19与Thy1.1共定位，明胶酶图法检测肝组织MMP-2，MMP-9活性。
结果：1.DMN大鼠肝纤维化形成与消减过程中肝脏卵圆细胞及其调控因子的动态变化。(1)DMN造模4w大鼠已形成典型的肝硬化，终止造模2w后，肝硬化已明显消减，呈肝纤维化的病理改变，肝功能也有所改善。(2)肝组织Thy1.1以及DICLSM检测肝组织AFP，CK19与Thy1.1共定位：正常大鼠未见到阳性表达；造模3d开始出现微量表达；随着DMN造模时间的延续而逐渐增加，而在终止DMN刺激后2w即模型6w时增加更为显著，明显高于造模4w时的水平；8w较6w时明显减少，接近造模4w时的水平。(3)肝组织MMP-9蛋白活性：正常大鼠肝组织中未见到MMP-9蛋白及活性表达；DMN造模3d的大鼠也未见到有表达；造模2w时有微量表达；而造模4w时的表达显著增加；在终止DMN刺激后2w后、即模型6w时蛋白表达量增加更为显著，活性变化不明显；8w时的表达量则较6w时显著减少。(4)HGF、SCF及TGFβ1等生长因子：正常对照大鼠肝组织中有一定量的HGF、SCF蛋白表达，未见到TGFβ1的表达；DMN造模组及停止造模后的各时间点HGF的表达量均低于正常大鼠；DMN造模3d后即开始降低，此后随着DMN造模时间的延续而呈梯级下降，终止DMN造模2w后、即模型6w时仍是较低水平的表达，直至终止DMN造模4w后、即模型8w时的表达较6w有显著增加。DMN造模3d时SCF蛋白有较多表达，造模2w、4w的表达量逐渐增加；停止DMN造模2w后、即模型6w时的表达量较造模4w显著增高；模型8w时便有所下降。造模3d的大鼠亦未见到TGFβ1蛋白表达，2w时可见微量表达，4w时的表达量显著高于造模2w；在终止DMN刺激2w后的表达显著高于造模4w；8w较6w时显著下降。
2、不同功效中医方剂对DMN肝纤维化大鼠肝卵圆细胞增殖、分化的影响。(1)血清肝功能：模型对照组血清ALT、AST活性及T.Bil含量显著增高，Alb含量显著降低。与模型对照组相比，黄芪汤组血清AST活性、T.Bil含量显著下降(P＜0.05)，Alb含量显著增加(P＜0.05)；一贯煎组血清AST活性、T.Bil含量显著下降(P＜0.05-0.01)；茵陈蒿汤组血清ALT、AST活性显著降低(P＜0.05-0.01)；虫草菌丝组血清T.Bil含量显著下降(P＜0.05)。(2)肝组织羟脯氨酸(Hyp)含量：模型对照组显著增加。与模型对照组相比，黄芪汤组显著降低(p＜0.05)；一贯煎组亦明显下降，但无显著性差异。(3)肝组织学观察：模型对照组大鼠肝细胞炎症减轻，以致密较细的不完全纤维间隔为主。黄芪汤组炎症基本消退，纤维间隔消退最明显；一贯煎组少量炎症细胞，于门脉区和小叶间可见较细纤维间隔；茵陈蒿汤组炎症消退，可见少量不完全纤维间隔；虫草菌丝组少量炎症细胞，不完全纤维间隔较粗。(4)肝组织α-SMA：与模型对照组比较，一贯煎、茵陈蒿汤及虫草菌丝组表达量显著降低，黄芪汤组表达量减少。(5)肝组织Thy1.1：与模型对照组比较，黄芪汤和一贯煎组显著增加，茵陈蒿汤及虫草菌丝组显著减少。(6)AFP与Thy1.1共定位：与模型对照组比较，一贯煎组阳性表达量显著增加(p＜0.01)；而黄芪汤组表达量显著降低(p＜0.01)；虫草菌丝组无显著变化。(7)CK19与Thy1.1共定位：与模型对照组比较，黄芪汤组阳性表达量显著增加(p＜0.01)，一贯煎组有所增加，虫草菌丝组显著减低(p＜0.05)。
结论：1、DMN大鼠肝硬化形成过程中存在肝脏卵圆细胞的动态变化，即细胞的数量随着肝纤维化程度的不断加重而增加；在停止DMN造模2w后，即于肝纤维化开始消减时，该细胞数量的增加更为显著，随着肝纤维化的消减、停止DMN造模4w后，其数量有所减少。表明肝脏卵圆细胞的此种动态变化与大鼠肝硬化的形成与消减的病理变化有关，尤其对肝纤维化的消减具有重要病理生理意义。
2、干细胞因子(SCF)表达量与MMP-9蛋白及其活性表达对DMN大鼠肝硬化形成与消减过程中HOC数量的动态变化具有重要作用。
3、转化生长因子(TGFβ1)在DMN大鼠肝硬化形成与逆转过程中可能起到控制肝脏卵圆细胞过度增殖的作用。
4、益气的黄芪汤与养阴的一贯煎可促进已经成型的DMN大鼠肝硬化的逆转，其主要作用机制可能与其直接促进HOC的表达数量有关；但对HOC分化取向的影响是不同的，益气的黄芪汤主要在于诱导HOC向胆管上皮细胞分化，而对HOC向肝细胞的分化有一定的抑制作用；养阴的一贯煎主要在于诱导HOC向肝细胞分化，同时也具有一定的促进HOC向胆管上皮细胞分化的作用。进一步深入研究该两个方剂诱导HOC分化的不同作用机制不仅有重要的应用价值，对中医药基础研究也将有重要的理论意义。