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A型流感病毒(Influenza A virus,IAV)尤其是强毒力毒株感染机体后,肺组织内的各种细胞释放大量的炎性介质,进而导致巨噬细胞等免疫细胞的炎性浸润,造成炎症性病理损伤,加重病毒感染的严重程度,是流感病毒感染高病死率的重要原因之一。因此,调控机体对流感病毒的过度免疫反应,减轻肺组织的炎性损伤,不失为研制有效的抗流感药物的重要手段。而且,由于IAV的高突变率,导致病毒对现有的多种抗流感病毒西药已经产生耐药性。鉴于此,研制新的广谱抗流感病毒药物或者寻找新的治疗方法,对于流感病毒的防治尤为关键。中药在治疗病毒性疾病等方面已积累了丰富的临床经验。中药可通过多种方式抑制病毒感染,例如抑制病毒复制、减轻由病毒感染介导的炎症反应、增强免疫力等方面。本文旨在筛选和验证能够对流感病毒感染介导的免疫损伤有干预作用的有效中药单体,为抗流感病毒的天然药物的研制奠定基础。方法:(1)通过CCK8法检测中药在MDCK细胞上对PR8感染的保护作用,对现有的60多种中药单体进行了筛选。CCK8实验检测中药对MDCK细胞半数中毒剂量(TD50),建立体外细胞感染模型,通过给予中药治疗后,RT-PCR与Western blot实验分别检测炎性细胞因子mRNA与流感病毒M与NP蛋白的表达水平;建立体内小鼠H1N1(PR8)感染模型,分为正常对照组、PR8组、中药治疗组(5 mg/kg/day、10 mg/kg/day、15 mg/kg/day),以磷酸奥司他韦(50mg/kg/day)为阳性对照组。结果评价以小鼠的平均日增重、存活天数以及小鼠成活率等为指标,判定中药在小鼠体内抗IAV感染的作用。同时制备肺组织的病理切片,分析中药对病毒感染介导的肺部炎症的影响。(2)表达并纯化出PA-X蛋白,通过常规的单抗制备方法,制备了PA-X单克隆抗体并且鉴定抗体的特异性。(3)采用二氢丹参酮I(DHT Ⅰ)与PA-X单抗联合使用的方法,研究对病毒感染介导的肺免疫损伤的保护作用。实验分为4组,分别为PR8组、DHT Ⅰ10mg/kg/day组、PA-X单抗组、DHT Ⅰ与PA-X单抗联合组。采用同样的方法检测了DHT Ⅰ与PA-X单抗联合用药对IAV介导的肺免疫损伤的保护作用。结果:(1)从60多种中药单体中共筛选出了5种对PR8感染引起的细胞病变有显著抑制作用的中药化合物,分别是山奈酚、异鼠李素、石菖蒲、芦丁以及二氢丹参酮I。CCK8体外细胞实验结果表明,DHT Ⅰ对MDCK细胞的TD50≤10μM;RT-PCR结果显示DHT Ⅰ能够显著降低PR8流感病毒M与NP基因的表达及炎性因子IL-6、IL-1β、TNF-α和IFN-β的表达,且Western blot结果表明DHT Ⅰ显著抑制流感病毒M与NP的表达,降低了MAPK ERK与JNK激酶的磷酸化水平。体内实验显示,DHT Ⅰ各剂量组小鼠的精神状态得到明显改善,肺指数显著降低,与病毒处理组相比,改善肺泡间隙不同程度的增宽,减少中性粒细胞浸润以及减轻肺泡壁充血、淤血程度明显减轻。(2)成功制备了PA-X单克隆抗体,通过ELISA及间接免疫荧光方法筛选,最终得到3株分泌McAbs的特异性细胞株,分别为2F3、5D6与3B4;并且对腹水抗体进行了纯化,抗体效价较高(1:51200),可以满足后续实验的需求。(3)DHT Ⅰ与PA-X单抗联合使用体内抗IAV的实验结果表明,各剂量处理组均可有效改善小鼠的存活情况,其中联合组存活率最高,与PR8组相比,肺指数均显著降低,证明二者联合使用可以改善IAV感染介导的肺免疫损伤。结论:本文是首次研究了DHT Ⅰ对IAV介导的肺免疫损伤的保护作用。结果发现,DHT Ⅰ在体内外实验中均表现出对病毒蛋白的表达具有显著抑制作用,并且可以抑制促炎细胞因子的表达(P<0.05);与PR8组相比,DHT Ⅰ对PR8感染介导的肺免疫损伤起显著的保护作用;并且采用二者联合抗IAV感染的实验发现,联合组的效果较DHT Ⅰ组与PA-X单抗组更显著。本文研究结果表明,DHT Ⅰ在辅助干预流感病毒所致的炎症损伤的方面有应用前景,也为以后能够开发出高效、特异的抗IAV药物与新的治疗方法积累材料。