论文部分内容阅读
目的:探讨赭曲霉毒素A(OTA)诱导人肾小管上皮(HK-2)细胞凋亡的过程;齐墩果酸(OA)拮抗OTA诱导HK-2细胞凋亡的作用;以及(肿瘤坏死因子相关受体1)TRAP1在OA拮抗OTA诱导HK-2细胞凋亡信号传导的机制。方法:1.本实验以人肾小管上皮(HK-2)细胞为实验模型,用不同浓度OTA处理细胞24 h后,使用CCK-8方法测定细胞存活率,确定OTA的工作浓度。设置对照组(C组,0μmol/L OTA处理24 h)、低剂量组(L组,0.2μmol/L OTA处理24 h)、中剂量组(M组,1μmol/L OTA处理24 h)和高剂量组(H组,5μmol/L OTA处理24 h)。使用OTA处理细胞所需时间后,用Annexin V-FITC/PI双染法测定细胞凋亡率,同时用Western blot方法测定凋亡相关蛋白TRAP1、Lonp1、CYPD、Cyt-C、Bcl-2、Bax、Cleaved Caspase-9、Cleaved Caspase-3、GRP78、p-PERK、p-eIF2α、ATF4和CHOP的表达。2.用不同浓度OA预处理细胞2 h后,使用CCK-8方法测定细胞存活率,确定OA的工作浓度。设置对照组(CK组,0μmol/L OTA处理24 h)、OTA组(OT组,5μmol/L OTA处理24 h)、OA对照组(OA组,2μmol/L OA预处理2 h)、先OA后OTA组(OO组,2μmol/L OA预处理2 h后5μmol/L OTA处理24 h)。使用OA和OTA处理细胞至所需时间后,采用CCK-8方法测定细胞存活率,Annexin V-FITC/PI双染法测定细胞凋亡率,Western blot方法测定凋亡相关蛋白TRAP1、Lonp1、CYPD、Cyt-C、Bcl-2、Bax、Cleaved Caspase-9、Cleaved Caspase-3、GRP78和CHOP的表达。3.用TRAP1 siRNA瞬时转染细胞5 h后,使用Western blot方法测定TRAP1siRNA对TRAP1的抑制效率。设置对照组(CK组,0μmol/L OTA处理24 h)、OTA组(OT组,5μmol/L OTA处理24 h)、OA对照组(OA组,2μmol/L OA预处理2 h)、先OA后OTA组(OO组,2μmol/LOA预处理2 h后5μmol/L OTA处理24 h)、转染后对照组(CK+组,TRAP1 siRNA转染5 h后,0μmol/L OTA处理24 h)、转染后OTA组(OT+组,TRAP1 siRNA转染5 h后,5μmol/L OTA处理24 h)、转染后OA对照组(OA+组,TRAP1 siRNA转染5 h后,2μmol/L OA处理2 h)、转染后先OA后OTA组(OO+组,TRAP1 siRNA转染5 h,2μmol/L OA预处理2 h后5μmol/L OTA处理24 h)。使用TRAP1 siRNA、OA和OTA处理细胞至所需要时间后,采用Western blot方法测定凋亡相关蛋白CYPD、Bcl-2、Bax、GRP78和CHOP的表达。结果:1.随着OTA浓度的增加,细胞存活率随之降低。与C组相比,L组细胞凋亡率略微增加(P>0.05),而M组和H组细胞凋亡率显著增加(P<0.05)。L组、M组和H组凋亡相关蛋白TRAP1、Lonp1、CYPD、Cyt-C、Bax、Cleaved Caspase-9、Cleaved Caspase-3、GRP78、p-PERK、p-eIF2α、ATF4和CHOP的表达逐渐增加,Bcl-2的表达逐渐降低,尤其是H组相关蛋白的改变具有显著差异(P<0.05)。2.2μmol/L OA预处理2 h能够显著提高细胞存活率(P<0.05)。与OT组相比,OO组能够显著降低细胞凋亡率(P<0.05)。除此之外,与OT组相比,OO组的凋亡相关蛋白TRAP1、Lonp1、CYPD、Cyt-C、Bax、Cleaved Caspase-9、Cleaved Caspase-3、GRP78和CHOP的表达显著减少(P<0.05),而Bcl-2的表达显著增加(P<0.05)。3.TRAP1 siRNA能够显著抑制TRAP1的表达(P<0.05)。使用TRAP1 siRNA瞬时转染5h后,与CK组、OT组、OA组和OO组分别相比,CK+组、OT+组、OA+组和OO+组凋亡相关蛋白CYPD、Bax、GRP78和CHOP的表达显著增加(P<0.05),而Bcl-2的表达显著降低(P<0.05)。结论:1.OTA可以引起HK-2细胞活力降低,并导致线粒体途径和内质网应激途径细胞凋亡的激活。2.OA可以拮抗OTA诱导的HK-2细胞活力降低,以及抑制OTA诱导的HK-2细胞线粒体途径和内质网应激途径细胞凋亡的激活。3.在OA拮抗OTA诱导HK-2细胞凋亡过程中,TRAP1抑制线粒体途径和内质网应激途径细胞凋亡相关信号传导。