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研究背景:肝细胞癌(HCC)是世界上致死率最高的三大癌症之一。HCC早期诊断困难,通常发现时已为晚期,且晚期肝细胞癌恶行程度高,终末期尚缺乏有效的治疗方式,因此总体预后很差。所以近些年来人们一直致力于开发抗肝癌的新型治疗方案。目的:构建一种具有靶向肝癌、携带siRNA、同时保留金纳米棒光热效应的三重功效为一体的多功能纳米系统GAL-GNR(GAL-MUA-PEI-GNR)。研究该纳米系统介导的靶向沉默小鼠肝癌细胞(Hepa1-6)中的GPC-3基因及对肝癌细胞的生物学功能影响。研究GAL-GNR的靶向性和光热效应,并确定GAL-GNR-siRNA介导的GPC-3基因沉默联合光热效应对小鼠肝癌的治疗效果。方法:1.GAL-GNR纳米载体的构建:采用经典的种子溶液生长法合成金纳米棒,并对金纳米棒进行功能化修饰。通过紫外可见光谱、透射电子显微镜、核磁共振氢谱、动态光散射粒度仪检测功能化修饰前后的金纳米棒。2.凝胶阻滞实验检测GAL-GNR对siRNA的加载能力和在血清中GAL-GNR对siRNA的保护作用。3.MTT法和Calcein-AM/PI双染色法检测功能化修饰前后的金纳米棒的细胞毒性。4.红外激光照射法检测GAL-GNR的光热转换能力。5.利用Cy3-siRNA检测GAL-GNR在Hapa1-6细胞中的转染效率,qPCR检测GAL-GNR-siGPC-3对Hapa1-6细胞的沉默效果。6.乳糖酸靶向竞争实验检测半乳糖结构对肝癌细胞的靶向作用。7.MTT法、划痕实验、transwell、集落克隆检测沉默GPC-3基因后对Hepa1-6细胞增值、侵袭、迁移及克隆形成能力的影响。8.冰冻切片法观察GAL-GNR-Cy3-siGAPDH在体内对肿瘤靶向作用。9.构建C57BL/6小鼠肝癌荷瘤模型,采用尾静脉注射给药,观察小鼠肝癌的治疗效果。10.检测小鼠血清中AST/GOT、ALT/GPT指标来评价GAL-GNR在小鼠体内的肝脏毒性;检测小鼠血清中肌酐、尿素指标来评价GAL-GNR在小鼠体内的肾脏毒性;检测小鼠的体重变化评价GAL-GNR对小鼠生命体征影响;HE染色法评价GAL-GNR对小鼠心肝脾肺肾主要脏器的影响。结果:1.与未经修饰的GNR相比,TEM结果显示GAL-GNR的尺寸无明显改变,并且仍然具有良好的分散性;在紫外可见吸收光谱中GAL修饰后的GNR与单独的GNR相比发生了明显红移;核磁共振氢谱显示GNR成功的连接上GAL分子。2.凝胶阻滞实验表明GAL-GNR与siRNA的最佳负载比例为6∶1(质量比);GAL-GNR可有效保护siRNA在血清中不被降解。3.MTT和Calcein-AM/PI双染色实验结果显示GAL-GNR的细胞毒性低,具有更好的生物相容性。4.红外激光照射实验结果显示GAL-GNR具有优秀的光热转换能力,其光热转换能力与材料浓度以及平均光照密度相关。5.红色荧光图像结果显示在GAL-GNR用量为30μg/mL时可达到最佳转染率,与阳性对照组结果相似,沉默效率约为75%。6.乳糖酸靶向竞争实验结果显示乳糖酸预处理可使GAL-GNR/Cy3-siRNA与肝癌细胞的结合能力明显变弱。7.GAL-GNR-siGPC-3可有效沉默肝癌细胞内的GPC-3基因,显著抑制小鼠肝癌肿瘤细胞的增殖、侵袭、迁移和克隆形成能力。8.组织冰冻切片结果显示,尾静脉注射GAL-GNR-Cy3-siGAPDH 24h后,GAL-GNR-Cy3-siGAPDH可明显蓄积至肿瘤组织。9.体内治疗结果显示,GPC-3基因沉默和光热效应能够协同抑制肿瘤的生长和肿瘤体积,减轻肿瘤质量。10.在肿瘤治疗过程中小鼠体重无明显减轻;血清中GOT、GPT、肌酐、尿素指标结果显示GAL-GNR具有较低的肝肾毒性;HE染色结果显示长时间的GAL-GNR治疗未发现对主要脏器的明显损伤,以上结果表明GAL-GNR具有良好的生物相容性。结论:1.本研究成功构建了一种集肿瘤靶向、基因沉默及光热转化为一体的新型纳米基因载体GAL-GNR-siRNA。2.GAL-GNR可以负载siRNA,有效保护其免受降解,且能有效地把siRNA导入Hepa1-6细胞中起到沉默GPC-3基因的效果,并能显著抑制肝癌细胞的增值、侵袭、迁移和克隆形成能力。3.GAL-GNR-siGPC-3介导的siRNA基因沉默联合光热疗法可以协同治疗肝癌荷瘤小鼠。