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研究目的探讨厚朴麻黄汤干预卵蛋白（OVA）诱导哮喘小鼠的效应,并从β2肾上腺素受体（β2AR）的调控探讨该方及各部位的效应机制,为该方临床研究提供理论依据。研究方法1.复制OVA诱导哮喘小鼠模型,采用厚朴麻黄汤对其干预,观察该方干预后经乙酰胆碱（Ach）激发的增强呼气间歇（Penh）变化、外周血和支气管肺泡灌洗液（BALF）中嗜酸性粒细胞（EOS）水平、肺病理损伤,ELISA测定BALF中炎症因子与介质的变化,qPCR、Western Blot（WB）法检测小鼠β2AR/β-arrestin2及紧密连接（TJs）mRNA和蛋白表达。2.复制OVA诱导哮喘小鼠模型,采用厚朴麻黄汤及石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、剩余水5个萃取部位对其干预,观察干预后经Ach激发的Penh变化、外周血EOS和BALF中白细胞水平、肺病理损伤,ELISA测定BALF中白细胞介素-4（IL-4）、白细胞介素-13（IL-13）水平的变化,qPCR检测小鼠β2AR/β-arrestin2 mRNA表达;并通过体外β2AR质粒转染293T细胞,双荧光素酶报告基因检测各部位对β2AR的激动作用,获得优效部位,与整体实验相互验证。3.对厚朴麻黄汤及优效部位进行UPLC-TQ/MS检测,确定其中的化学成分,通过分子对接将确定成分与β2AR靶点进行虚拟对接。将亲和力得分较高的成分及优效部位的成分进行相互结合,通过双荧光素酶报告基因检测化学成分对β2AR的激动作用。研究结果1.厚朴麻黄汤对OVA诱导小鼠哮喘的影响:对OVA诱导哮喘小鼠模型干预后,①气道高反应性Penh值显示:模型组小鼠明显升高;当6.25 g/L浓度Ach时,各给药组明显降低,且中剂量组显著降低;12.5 g/L浓度Ach时,厚朴麻黄汤低、中剂量组显著降低;25 g/L浓度Ach时,各给药组明显降低且中剂量组显著降低;50 g/L浓度Ach时,各给药组显著降低。②外周血EOS数量及BALF中EOS百分占比:模型组两指标均显著增高,各给药组外周血EOS数显著降低;厚朴麻黄汤中、高剂量组BALF中EOS百分占比显著降低。③肺组织病理变化:模型组小鼠支气管壁有大量炎症细胞浸润,支气管黏膜水肿、增厚,管腔狭窄,黏液分泌增多,支气管纤毛上皮部分脱落;各给药组的肺组织病理出现不同程度减轻,且厚朴麻黄汤中剂量组减轻最明显。④IL-4,IL-13,PGD2,SP水平变化:模型组明显升高;厚朴麻黄汤中剂量组及阳性药组IL-4水平显著降低,厚朴麻黄汤低、高剂量组明显降低;厚朴麻黄汤中、高剂量组和阳性药组IL-13水平显著降低;厚朴麻黄汤三个剂量组、阳性药组PGD2水平显著降低,厚朴麻黄汤中、高剂量组和阳性药组SP水平显著降低。⑤β2AR/β-arrestin2和TJs相关基因与蛋白表达:模型组β2AR/β-arrestin2基因与蛋白表达显著降低;ZO-1、occludin基因与蛋白表达明显降低,claudin-2表达明显升高;各给药组β2AR/β-arrestin2明显改善,且紧密连接相关蛋白基因出现回调（以上结果均P＜0.05）。2.厚朴麻黄汤各萃取部位对OVA诱导小鼠哮喘的影响及对β2AR的激动作用的筛选:①气道高反应性Penh值显示:模型组小鼠显著升高,各给药组均出现不同程度降低。②外周血EOS数量及BALF中白细胞数量:模型组的外周血EOS数量显著增高,沙丁胺醇组、厚朴麻黄汤组、乙酸乙酯组和正丁醇组外周血EOS数量显著降低,剩余水组明显降低;模型组BALF中白细胞数量显著增高,其他各给药组白细胞数量明显降低。③肺组织病理变化:空白组病理学改变不明显,肺泡壁内无充血、水肿的情况,气道上皮细胞无损伤情况;模型组中有大量炎细胞浸润在支气管周围,支气管的上皮细胞变性坏死、管壁增厚、管腔内大量黏液;各给药组病理出现不同程度的减轻。④IL-4,IL-13水平变化:模型组IL-4、IL-13水平均显著升高,IL-4水平在沙丁胺醇组、厚朴麻黄汤组及乙酸乙酯组显著降低,正丁醇组、剩余水组明显降低;IL-13水平在沙丁胺醇组显著降低,厚朴麻黄汤组、乙酸乙酯组及正丁醇组明显降低。⑤β2AR/β-arrestin2基因表达:模型组β2AR/β-arrestin2 mRNA表达显著降低,β2AR mRNA中沙丁胺醇组、厚朴麻黄汤组、石油醚组、乙酸乙酯组、正丁醇组显著升高,氯仿组、剩余水组明显升高;β-arrestin2 mRNA中沙丁胺醇组、厚朴麻黄汤组显著升高,乙酸乙酯组、正丁醇组明显升高。⑥厚朴麻黄汤及各部位安全浓度筛选:通过CCK8筛选药物浓度,最终选取厚朴麻黄汤55、70、85μg/mL,石油醚部位2.5、5、10μg/mL,氯仿部位10、20、30 μg/mL,乙酸乙酯部位60、80、100μg/mL,正丁醇部位10、20、30 μg/mL,剩余水部位60、80、100 μg/mL,沙丁胺醇浓度为40 μmol/L。⑦双荧光素酶报告基因检测:与空白组比,相对荧光比值中沙丁胺醇组,厚朴麻黄汤组（70 μg/mL、85 μg/mL）,石油醚组（10 μg/mL）,氯仿组（30 μg/mL、10 μg/mL）,乙酸乙酯组（100 μg/mL、80 μg/mL、60 μg/mL）,正丁醇组（30 μg/mL、10 μg/mL）均显著升高,氯仿组（20 μg/mL）、剩余水组（60 μg/mL）明显升高（以上结果均P＜0.05）。3.厚朴麻黄汤及优效部位成分对β2AR的激动作用:①厚朴麻黄汤中主要成分:通过UPLC-TQ/MS联用技术方法进行分析,共鉴定出44种成分,其中包含麻黄、伪麻黄碱、苦杏仁苷、木兰箭毒碱等化合物。②β2AR靶点分子对接:除1个成分未对接上,其中29个成分亲和力得分绝对值在4分以上,得分前几位的成分为芦丁、苦杏仁苷、野黑樱苷、麻黄碱等,主要来源于厚朴、麻黄和苦杏仁三味药。③厚朴麻黄汤乙酸乙酯部位主要成分:结合标准品比对,共鉴定出五味子甲素、五味子乙素、五味子酯甲、五味子醇甲、芦丁、金丝桃苷、野黑樱苷、木兰箭毒碱、苦杏仁苷、伪麻黄碱、麻黄碱、鸟苷12个单体成分。④化学成分安全浓度筛选:经CCK8药物浓度筛选后,选取浓度为10μmol/L进行后续实验。⑤双荧光素酶报告基因检测:单体相对荧光值由高至低顺序依次为:麻黄碱＞伪麻黄碱＞金丝桃苷＞野黑樱苷＞五味子醇甲＞鸟苷＞苦杏仁苷＞芦丁＞五味子甲素＞木兰箭毒碱。结论1.厚朴麻黄汤可以改善模型小鼠气道反应性、气道炎症、肺病理损伤。降低外周血EOS 及 BALF 中 IL-4、IL-13、PGD2、SP 水平,调控 β2AR/β-arrestin2 以及紧密连接 ZO-1、occludin、claudin-2基因与蛋白的表达。2.厚朴麻黄汤各萃取部位均能不同程度的改善模型小鼠气道反应性、肺病理损伤、降低外周血EOS及BALF中白细胞、IL-4、IL-13水平,调控β2AR/β-arrestin2基因表达;除厚朴麻黄汤组以外,乙酸乙酯组在各部位中效果较优。采用双荧光素酶报告基因检测,发现各部位中乙酸乙酯组对β2AR激动作用较强。3.经分子对接结合双荧光素酶报告基因检测,发现对β2AR具有激动作用的乙酸乙酯部位中主要成分为:麻黄碱、伪麻黄碱、金丝桃苷、野黑樱苷、五味子醇甲、鸟苷、苦杏仁苷、芦丁、五味子甲素和木兰箭毒碱。