自然杀伤细胞(natural killer cells, NK cell)是天然免疫系统的重要组成细胞。与T、B细胞不同,NK细胞无需致敏就可对肿瘤和病毒感染的靶细胞产生快速应答,主要通过直接杀伤和分泌多种细胞因子的方式来发挥其效应功能,是机体抵御外来病原体入侵的第一线细胞。近年来越来越多的研究表明,NK细胞并不是单一表型和功能的细胞,而是异质性的细胞群体。NK细胞在人类和小鼠中的异质性和相应的分类均有报道。在小鼠中,根据NK细胞的组织分布特点或不同发育成熟阶段,NK细胞被划分成表型和功能迥异的各种亚群。对NK细胞的细化分类研究,不仅有利于了解NK细胞的基本生物学特性,更重要的是,对临床NK细胞的治疗也有着深远意义。肝脏是机体重要的免疫器官。它独具特色的血液供应机制和生理结构,一方面需要肝脏免疫系统进行精细调节才能维持稳态,另一方面也造就了肝脏的免疫优势状态。肝脏的天然免疫优势状态主要体现在肝脏含有种类丰富和数量庞大的天然免疫细胞,其中,作为天然免疫系统成员的NK细胞就富集于肝脏中。不仅如此,肝脏NK细胞的表型也十分特殊,一群表型不成熟的NK细胞始终在肝脏以高比例的形式存在,而在外周其它部位,占主导地位的是成熟表型的NK细胞。尽管这一现象早在十年前就被报道,但目前人们对肝脏这群特殊NK细胞的认识仍然存在许多空白。它们是从骨髓发育而来的还是在肝脏中直接发育而来?它们在肝脏中是否行使特殊的功能?哪些因素能够维持和影响它们的存在?这些问题至今还没有得到解答的重要原因在于,对肝脏特有NK细胞表型和功能的基本特性的认识有限,并且缺乏特异性的分子标志来对这群细胞进行鉴定。本研究的目的之一就是拓宽对于肝脏特有NK细胞表型和功能的认识,以及寻找特异性阳性标志。NK细胞在机体抗病毒感染的早期过程中发挥着重要作用。在许多不同的病毒感染模型中,肝脏NK细胞会骤增并活化,在揭示肝脏NK细胞的这种变化的同时,已有的这些研究关注点主要放在NK细胞参与的抗病毒反应或炎症反应中的作用,而对前期过程中NK细胞是通过何种机制聚集于肝脏的研究却甚少,这是本研究将要解决的另一个问题。基于上述出发点,我们主要从以下两大部分展开研究：Ⅰ.肝脏特有NK细胞的特性研究1.肝脏存在高比例的DX5-NK细胞首先,我们通过流式检测DX5在C57BL/6小鼠的肝脏、脾脏、外周血、骨髓和腹股沟淋巴结中NK细胞上的表达情况。结果发现,肝脏NK细胞中有一半左右为DX5阴性,而其它组织器官中90%以上的NK细胞为DX5阳性。2.肝脏DX5-NK细胞与其它NK细胞亚群具有显著差异对肝脏DX5-与DX5+NK细胞进行小鼠全基因芯片分析,结果发现这两群NK细胞在基因表达谱方面存在广泛的差异,表达有显著差异的基因包括活化性/抑制性受体,细胞因子及受体,趋化因子及受体,粘附分子,杀伤功能效应分子和转录因子等等,这些差异基因给后续肝脏特有NK细胞的特性研究带来了启示。我们又通过流式对这两群NK细胞的表面分子表达进行了大量对比,一方面验证了基因芯片中的结果,另一方面则进一步揭示了肝脏DX5-NK细胞具有不成熟NK细胞的表型特征。功能研究结果显示,肝脏DX5-NK细胞的杀伤能力和分泌IFN-γ的能力比DX5+NK细胞要弱。此外,我们还对肝脏与其它脏器相对应的NK细胞亚群之间进行了表型比较。结果表明,肝脏中的DX5-NK细胞与其它脏器少量存在着的DX5-NK相比,表型上有一定差异,而肝脏中的与其它脏器中的DX5+NK相比,则没有明显区别。这说明过去报道的肝脏NK细胞表型特殊主要归因于肝脏中DX5-NK细胞的存在。3.肝脏特有DX5-NK细胞的迁移和发育特性我们通过转输实验研究了肝脏NK细胞亚群的发育和迁移特性,结果发现,转输的肝脏DX5-NK细胞在受体鼠中仍然只驻留于肝脏,并且维持原有的表型特征,而供者的DX5+NK细胞在受者的肝脏和脾脏中均有分布。由此我们认为肝脏特有的DX5-NK细胞是肝脏驻留的细胞,而且在没有外界刺激的情况下,这群细胞不会进一步发育分化而获得成熟的表型；与此相反,DX5+NK细胞则具有很强的迁移能力,在全身广泛分布,代表着绝大部分的外周NK细胞。4.CD49a作为肝脏特有DX5-NK细胞的特异性标志基因芯片的结果揭示肝脏DX5-NK细胞高表达CD49a,流式检测则进一步发现肝脏DX5-NK细胞几乎全为CD49a阳性,而肝脏DX5+NK细胞和其它脏器NK细胞几乎不表达CD49a。在RAG-1缺陷鼠和BALB/c小鼠中,也同样发现肝脏特异性存在一群CD49a+NK细胞。综上所述,CD49a分子能够作为肝脏特有NK细胞的特异性标志。5.肝脏特有NK细胞的特殊功能已有的报道发现肝脏NK能够介导半抗原特异性的超敏反应,并且该过程依赖于CXCR6,但是具体由哪个NK细胞亚群所介导却并不清楚。我们的检测结果发现,CXCR6在肝脏特有NK细胞上表达较高,并且肝脏特有NK细胞能够介导超敏反应,而在外周中广泛存在的NK细胞亚群则不能；此外,半抗原致敏后,携带半抗原的细胞能够进入肝脏,为肝脏特有NK细胞发挥记忆功能提供了必要基础。结论Ⅰ：本文对肝脏NK细胞的表型,功能和迁移发育特性进行了系统性描述,为组织微环境与NK细胞之间的互相影响及其内在机理提供了参考依据,对研究NK细胞在中枢淋巴器官之外的场所发育分化提供了重要线索,也是对已有关于NK细胞基本生物学特征的认识的重要补充。Ⅱ.病毒感染过程中CD62L参与NK细胞在肝脏的聚集和成熟1.CD62L在静息NK细胞上的表达特性对正常C57BL/6小鼠各脏器NK细胞上CD62L表达的检测结果显示,CD62L在肝脏NK细胞上的表达水平最低(不到50%),其次是骨髓,而脾脏、外周血和淋巴结的NK细胞大部分为CD62L阳性；进一步对CD62L和CD62L+NK细胞的表型进行对比,结果发现NK细胞成熟相关的标志在CD62L+NK细胞上表达较高；对不同年龄小鼠的NK细胞进行检测,发现CD62L的表达是从无到有,逐渐上升的过程；此外,转输实验发现,转输的CD62L-NK细胞可以发育分化成CD62L阳性,但转输的CD62L+NK细胞仍然为CD62L阳性,说明NK细胞获得CD62L的表达是一个不可逆的过程。总之,这部分结果说明在静息状态下,CD62L-和CD62L+NK细胞具有不同的组织分布特性,并且相比较而言,CD62L+NK细胞代表着更成熟的NK细胞群体。2. Poly I:C引起肝脏NK细胞变化我们对小鼠注射poly I:C来模拟RNA病毒感染,结果发现,在注射后的18小时即观察到肝脏NK细胞的大量增加和活化,并且与静息状态相比,此时肝脏NK细胞表型更为成熟。通过转输实验发现,poly I:C刺激能够加剧肝脏CD62L NK细胞向CD62L+转变,同时促进外周NK细胞向肝脏聚集。3. Poly I:C引起肝脏NK细胞的变化依赖于CD62L在对小鼠给予poly I:C刺激前预先阻断CD62L,则会观察到NK细胞在肝脏中的聚集受到抑制,并且肝脏NK细胞表型的进一步成熟也得到抑制,这说明poly I:C刺激引起的肝脏NK细胞的变化依赖于CD62L。4.CD62L的阻断抑制腺病毒感染引起的肝脏NK细胞变化为了验证上述poly I:C引起的现象和机制是否也适用于其它病毒感染模型。我们用到了DNA病毒——腺病毒感染的小鼠模型,结果发现,腺病毒感染后小鼠肝脏NK细胞的比例迅速增多并且CD62L表达水平显著上调,而如果预先阻断CD62L,肝脏NK细胞的增加和成熟就会受到抑制。结论Ⅱ：本文阐述了病毒感染后肝脏NK细胞的变化,即数量增加和表型成熟,并且发现这种变化依赖于CD62L分子,为研究NK细胞在人类病毒性肝脏疾病中的作用机制提供了新的思路；同时也论述了CD62L与NK细胞发育成熟的关系,得到了小鼠NK细胞成熟过程中逐渐获得CD62L表达的结论,CD62L-NK细胞向CD62L+的转变可发生在骨髓以外的脏器,如肝脏和脾脏,为NK细胞的骨髓外发育分化提供了重要补充。