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癌性转录因子c-Maf是非常理想的多发性骨髓瘤(MM)治疗靶点，但尚无有效的靶向策略。我们前期的质谱研究结果发现，卵巢肿瘤家族去泛素化酶Otub1可以与c-Maf结合，进一步研究发现Otub1可以抑制c-MafK48类型的泛素化进而阻止c-Maf降解，促进其转录活性。因此，靶向Otub1/c-Maf轴可能是靶向c-Maf的有效方法。但Otub1在MM进展中的功能尚不明确，本课题中我们首先分析了Otub1在MM细胞及动物水平的作用，发现Otub1促进MM细胞存活及MM肿瘤生长。相反，敲低Otub1导致c-Maf蛋白降解及MM细胞凋亡。因此，Otub1/c-Maf轴可作为MM的药物筛选靶点。为了进一步探索这一设想，我们构建了基于c-Maf转录活性的Otub1/c-Maf通路抑制剂筛选系统筛选了FDA批准上市的药物库和天然化合物库，寻找到了三种潜在抑制剂:强心苷类化合物毛花苷C(LanC)、南昌霉素(Nam)、乙酰缬草素(AVT)。本课题中，我们发现这三种化合物可以抑制Otub1对c-Maf的去泛素化作用，诱导c-Maf蛋白降解。进而抑制c-Maf转录，诱导MM细胞凋亡，抑制MM模型中小鼠肿瘤生长且没有毒性作用。此外，我们还发现Nam可以抑制Otub1对MDM2的去泛素化作用，下调MDM2蛋白水平，抑制MDM2非p53依赖型癌基因功能，诱导恶性血液肿瘤细胞凋亡并抑制恶性血液肿瘤小鼠中肿瘤生长。总之，本研究证明了Otub1在MM中的癌基因功能，并证明靶向Otub1/c-Maf是治疗MM的潜在靶点。
目的:初步探究Otub1在MM细胞及动物水平中的功能，并基于Otub1对c-Maf转录活性的促进作用构建Otub1/c-Maf通路抑制剂筛选系统，从FDA批准的药物和天然化合物中筛选Otub1的潜在抑制剂。进一步验证筛选结果后探究这些潜在抑制剂抗MM的作用及机制，为靶向Otub1/c-Maf通路治疗MM提供药理学依据。
方法:
(1)收集MM患者及正常捐献者骨髓标本，RT-PCR分析Otub1表达水平并查阅相关数据库分析Otub1在MM进展阶段中的表达;同时，在MM细胞株中过表达和敲低Otub1，分析Otub1对MM细胞增殖、凋亡的影响，并在MM播散动物模型中验证这一结论。此外，查阅PROGgene数据库，分析Otub1对MM患者预后的影响。
(2)构建稳定表达c-Maf、Otub1和MARE.Luci质粒的HEK293T细胞株，经FDA批准上市药物和天然化合物处理后，荧光素酶实验筛选抑制c-Maf转录活性的化合物。此后，挑选显著下调c-Maf转录活性的化合物处理MM细胞株，WB检测候选化合物对c-Maf蛋白水平的影响及抗MM活性。经文献查阅及分析选择下调c-Maf蛋白水平，诱导MM细胞凋亡且无毒的化合物进一步研究。最后，经MTT、RT-PCR、WB技术验证候选化合物抑制MM细胞增殖、抑制c-Maf转录作用，并寻找候选化合物合适的药物使用浓度。
(3)采用WB、MTT、RT-PCR、流式细胞术检测LanC、Nam、AVT对多种MM细胞株增殖、凋亡影响是否有选择性，同时分析这三种化合物对c-Maf蛋白和mRNA水平的影响，并进行IP实验检测c-Maf泛素化水平，判断这三种潜在抑制剂是否影响c-Maf的泛素化修饰。此外，分别敲低和过表达Otub1后，WB、IP、荧光素酶实验检测LanC、Nam、AVT对MM细胞凋亡、c-Maf泛素化水平及转录活性的影响，以判别Otub1在这些化合物发挥抗肿瘤功能过程中的作用。
(4)在体内实验中，构建恶性血液病皮下移植瘤模型和MM播散模型，经LanC、Nam和AVT治疗后，分析肿瘤生长速率、荷瘤小鼠生存期及肿瘤组织中c-Maf、Otub1等相关蛋白水平的变化以及小鼠体重、生化指标等评价药物毒性。此外，克隆形成实验分析LanC、Nam和AVT对MM患者骨髓细胞克隆形成的影响。
结果:
(1)RT-PCR分析发现MM患者骨髓细胞中Otub1mRNA表达水平显著高于正常捐献者，数据库检索结果也发现Otub1的表达水平在MGUS、MM中表达水平高于正常捐献者。此外，过表达Otub1促进MM细胞增殖，相反的，敲低Otub1下调c-Maf蛋白水平，诱导MM细胞凋亡。并且过表达Otub1可缩短MM细胞株RPMI-8226小鼠生存期，与此一致的是，高表达Otub1的MM患者生存期要低于低表达Otub1的患者。
(2)我们基于c-Maf转录活性筛选出三种候选化合物LanC、Nam和AVT。WB、MTT、RT-PCR和荧光素酶实验发现这三种化合物可下调c-Maf蛋白水平，抑制c-Maf转录，诱导MM细胞凋亡，降低MM细胞活力，呈现出较好的抗MM活性。
(3)MTT和流式细胞术检测发现LanC和AVT可诱导高表达c-Maf的MM细胞凋亡，降低其细胞活力，但对低表达c-Maf的MM细胞株无此作用。WB、IP检测发现LanC和AVT可促进c-MafK48类型的泛素化，降低c-Maf蛋白水平，减少c-Maf与Otub1结合，并且Otub1缺失时，LanC和AVT作用减弱，同样的，过表达c-Maf可拮抗LanC和AVT的作用。而Nam对几乎所有MM细胞株和多种类型白血病细胞株表现出极好的抗肿瘤活性，除了可下调c-Maf蛋白水平外，还促进MDM2泛素化，诱导MDM2蛋白降解，并且此过程须Otub1的参与。
(4)体内动物实验及集落形成实验证实了LanC和AVT可抑制肿瘤的生长，延长荷瘤小鼠的生存期，并且抑制MM骨髓细胞集落形成。Nam可抑制白血病和骨髓瘤模型中肿瘤生长并且可抑制MM和白血病细胞集落形成。
结论:
Otub1可通过稳定c-Maf促进MM进展，基于此构建的Otub1/c-Maf通路抑制剂筛选系统发现了三种潜在抑制剂LanC、Nam和AVT。这三种化合物均能促进c-Maf降解，抑制c-Maf转录活性，诱导MM细胞凋亡。其中LanC和AVT可抑制Otub1与c-Maf结合，引起高表达c-Maf的MM细胞株凋亡，并抑制皮下肿瘤生长。Nam不仅可抑制c-Maf/Otub1通路，还可通过抑制Otub/MDM2，促进MDM2泛素化，调节其下游Rb/E2F通路和p21蛋白水平，诱导恶性血液肿瘤细胞凋亡，且该作用不依赖于p53的功能。
目的:初步探究Otub1在MM细胞及动物水平中的功能，并基于Otub1对c-Maf转录活性的促进作用构建Otub1/c-Maf通路抑制剂筛选系统，从FDA批准的药物和天然化合物中筛选Otub1的潜在抑制剂。进一步验证筛选结果后探究这些潜在抑制剂抗MM的作用及机制，为靶向Otub1/c-Maf通路治疗MM提供药理学依据。
方法:
(1)收集MM患者及正常捐献者骨髓标本，RT-PCR分析Otub1表达水平并查阅相关数据库分析Otub1在MM进展阶段中的表达;同时，在MM细胞株中过表达和敲低Otub1，分析Otub1对MM细胞增殖、凋亡的影响，并在MM播散动物模型中验证这一结论。此外，查阅PROGgene数据库，分析Otub1对MM患者预后的影响。
(2)构建稳定表达c-Maf、Otub1和MARE.Luci质粒的HEK293T细胞株，经FDA批准上市药物和天然化合物处理后，荧光素酶实验筛选抑制c-Maf转录活性的化合物。此后，挑选显著下调c-Maf转录活性的化合物处理MM细胞株，WB检测候选化合物对c-Maf蛋白水平的影响及抗MM活性。经文献查阅及分析选择下调c-Maf蛋白水平，诱导MM细胞凋亡且无毒的化合物进一步研究。最后，经MTT、RT-PCR、WB技术验证候选化合物抑制MM细胞增殖、抑制c-Maf转录作用，并寻找候选化合物合适的药物使用浓度。
(3)采用WB、MTT、RT-PCR、流式细胞术检测LanC、Nam、AVT对多种MM细胞株增殖、凋亡影响是否有选择性，同时分析这三种化合物对c-Maf蛋白和mRNA水平的影响，并进行IP实验检测c-Maf泛素化水平，判断这三种潜在抑制剂是否影响c-Maf的泛素化修饰。此外，分别敲低和过表达Otub1后，WB、IP、荧光素酶实验检测LanC、Nam、AVT对MM细胞凋亡、c-Maf泛素化水平及转录活性的影响，以判别Otub1在这些化合物发挥抗肿瘤功能过程中的作用。
(4)在体内实验中，构建恶性血液病皮下移植瘤模型和MM播散模型，经LanC、Nam和AVT治疗后，分析肿瘤生长速率、荷瘤小鼠生存期及肿瘤组织中c-Maf、Otub1等相关蛋白水平的变化以及小鼠体重、生化指标等评价药物毒性。此外，克隆形成实验分析LanC、Nam和AVT对MM患者骨髓细胞克隆形成的影响。
结果:
(1)RT-PCR分析发现MM患者骨髓细胞中Otub1mRNA表达水平显著高于正常捐献者，数据库检索结果也发现Otub1的表达水平在MGUS、MM中表达水平高于正常捐献者。此外，过表达Otub1促进MM细胞增殖，相反的，敲低Otub1下调c-Maf蛋白水平，诱导MM细胞凋亡。并且过表达Otub1可缩短MM细胞株RPMI-8226小鼠生存期，与此一致的是，高表达Otub1的MM患者生存期要低于低表达Otub1的患者。
(2)我们基于c-Maf转录活性筛选出三种候选化合物LanC、Nam和AVT。WB、MTT、RT-PCR和荧光素酶实验发现这三种化合物可下调c-Maf蛋白水平，抑制c-Maf转录，诱导MM细胞凋亡，降低MM细胞活力，呈现出较好的抗MM活性。
(3)MTT和流式细胞术检测发现LanC和AVT可诱导高表达c-Maf的MM细胞凋亡，降低其细胞活力，但对低表达c-Maf的MM细胞株无此作用。WB、IP检测发现LanC和AVT可促进c-MafK48类型的泛素化，降低c-Maf蛋白水平，减少c-Maf与Otub1结合，并且Otub1缺失时，LanC和AVT作用减弱，同样的，过表达c-Maf可拮抗LanC和AVT的作用。而Nam对几乎所有MM细胞株和多种类型白血病细胞株表现出极好的抗肿瘤活性，除了可下调c-Maf蛋白水平外，还促进MDM2泛素化，诱导MDM2蛋白降解，并且此过程须Otub1的参与。
(4)体内动物实验及集落形成实验证实了LanC和AVT可抑制肿瘤的生长，延长荷瘤小鼠的生存期，并且抑制MM骨髓细胞集落形成。Nam可抑制白血病和骨髓瘤模型中肿瘤生长并且可抑制MM和白血病细胞集落形成。
结论:
Otub1可通过稳定c-Maf促进MM进展，基于此构建的Otub1/c-Maf通路抑制剂筛选系统发现了三种潜在抑制剂LanC、Nam和AVT。这三种化合物均能促进c-Maf降解，抑制c-Maf转录活性，诱导MM细胞凋亡。其中LanC和AVT可抑制Otub1与c-Maf结合，引起高表达c-Maf的MM细胞株凋亡，并抑制皮下肿瘤生长。Nam不仅可抑制c-Maf/Otub1通路，还可通过抑制Otub/MDM2，促进MDM2泛素化，调节其下游Rb/E2F通路和p21蛋白水平，诱导恶性血液肿瘤细胞凋亡，且该作用不依赖于p53的功能。