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猪细小病毒（Porcine Parvovirus,PPV）是引起母猪繁殖障碍的主要病毒性病原之一,可导致母猪不孕、流产、产死胎、弱胎及木乃伊胎等。PPV常与其它病原体混合感染,如猪圆环病毒、猪乙型脑炎病毒、猪伪狂犬病毒及猪繁殖与呼吸综合征病毒等,加重其危害。近年来不断有研究报道从临床发病猪体中分离到新的PPV突变株,且多次从免疫接种猪群体内分离得到新的PPV亚型,以致PPV一直是猪病研究与防控中的重点。目前对PPV的研究主要集中在快速检测方法及疫苗上,对PPV全基因组结构及主要蛋白的功能已有较深入的了解,但有关PPV感染引起猪的免疫机理及发病机制尚不清楚,严重制约了新型疫苗和有效药物的研发。为此,开展PPV与宿主细胞相互作用机制研究,在此基础上研发PPV的抗病毒药物和有效疫苗已变得极其紧迫。Toll样受体（TLRs）是近年来发现的人细胞表面存在的一种跨膜信号转导受体,可以识别特定的微生物病原体,TLRs信号通路的活化在机体完成各种生命活动的过程中发挥着重要作用,TLRs识别配体后,将信号传递给接头分子,经一系列信号级联途径,激活核转录因子（NF-κB）,活化后的NF-κB从细胞质进入到细胞核内,与细胞核内各种炎性因子的DNA结合进而上调炎性因子的表达,从而引起机体强烈的炎症反应。PPV编码的非结构蛋白NS1是一种反式激活蛋白,是PPV DNA复制所必须的,对PPV的转录具有重要的调节作用。实验室前期已证实PPV感染细胞后通过TLR2、TLR7和TLR9进而激活NF-κB信号通路调控下游炎性细胞因子的表达,但PPV编码的非结构蛋白NS1是否也能通过激活NF-κB信号通路调控下游炎性细胞因子的表达,尚不清楚,因此我们进行了如下试验:1、为了研究PPV非结构蛋白NS1对细胞分泌炎性因子的影响,首先构建了带有绿色荧光蛋白（GFP）的真核表达载体p EGFP-N1-NS1,并转染至293T细胞,通过荧光显微镜观察目的基因在细胞内的表达情况,结果显示重组质粒p EGFP-N1-NS1在293T细胞内成功表达。应用荧光定量PCR和酶联免疫吸附试验（ELISA）检测p EGFP-N1-NS1转染293T细胞后IL-6和TNF-α在m RNA水平和蛋白水平的表达情况。结果显示转染p EGFP-N1-NS1后IL-6和TNF-α分泌量大量增加,与细胞空白对照组相比差异极显著（P＜0.01）,表明PPV非结构蛋白NS1在细胞中表达后可引起细胞分泌炎性细胞因子IL-6和TNF-α。2、为了探明PPV非结构蛋白NS1引起细胞炎性因子释放的作用机制,首先通过荧光定量PCR试验检测PPV NS1重组质粒转染293T细胞后NF-κB信号通路相关基因在m RNA水平的变化,结果显示p EGFP-N1-NS1转染293T细胞后NF-κB信号通路相关基因在m RNA水平的表达均上调,与细胞对照组差异极显著（P＜0.01）。在三个TLRs因子中,TLR2在转染后1 h表达量即达到了对照组的5.0×10~4倍,12 h时达到最大值,约为对照组的1.0×10~5倍,36 h开始下降,至48 h时仍为对照组的2.5×10~3倍,我们推测PPV NS1转染细胞后通过TLR2引起NF-κB信号通路相关因子的大量表达。应用Western blot对NF-κB（p65）蛋白的表达进行了检测,结果显示,细胞内p65的总量基本不变,而细胞核内p65的表达量从3 h开始逐渐增加,且48 h达到最大,细胞浆内p65的表达量从1 h开始逐渐减少,24 h后表达量又开始增加,表明PPV NS1蛋白促进了p65从细胞质转移到细胞核中。为进一步验证PPV NS1转染293T细胞后通过激活NF-κB引起炎性细胞因子IL-6的表达,将10μM的NF-κB抑制剂BAY11-7082作用于293T细胞,结果显示抑制剂作用细胞后PPV NS1激活IL-6炎性因子的能力显著降低,表明PPV NS1引起IL-6炎性因子的表达是通过TLR2介导的信号转导激活NF-κB信号通路,使活化的NF-κB（p65）转位入核后,调控下游炎性因子的转录和表达的。3、为了确定PPV非结构蛋白NS1激活NF-κB的功能域,应用结构域在线分析软件Simple Modular Architecture Research Tool,SMART分析了PPV NS1主要包含三个结构域,即NS1-1（186 aa-265 aa）、NS1-2（358 aa-493 aa）、NS1-3（551 aa-662 aa）,分别构建PPV NS1三个结构域区域的真核表达载体p EGFP-N1-NS1-1、p EGFP-N1-NS1-2和p EGFP-N1-NS1-3,并在293T细胞内成功表达。应用荧光定量PCR检测p EGFP-N1-NS1-1、p EGFP-N1-NS1-2和p EGFP-N1-NS1-3转染293T细胞后NF-κB在m RNA水平的表达情况,结果显示p EGFP-N1-NS1-1和p EGFP-N1-NS1-2转染细胞后NF-κB在m RNA水平的表达均发生了显著变化,而p EGFP-N1-NS1-3转染细胞后对NF-κB的表达影响不大。表明NS1-1与NS1-2能够激活NF-κB信号通路。随后通过荧光定量PCR试验检测p EGFP-N1-NS1-1和p EGFP-N1-NS1-2转染293T细胞后TLR2、TLR7和TLR9 m RNA水平的表达情况,结果显示p EGFP-N1-NS1-1和p EGFP-N1-NS1-2均能引起TLR2、TLR7和TLR9在m RNA水平发生变化,但p EGFP-N1-NS1-2引起TLR2的变化更加明显,最低表达量仍为对照组的4.7×10~5倍,表明PPV NS1通过TLR2激活NF-κB引起炎性因子的表达主要是PPV NS1的NS1-2起作用的。最后采用ELISA方法对p EGFP-N1-NS1-2转染293T细胞后细胞分泌的IL-6和TNF-α浓度进行检测,结果发现p EGFP-N1-NS1-2转染293T细胞后能够引起细胞炎性因子IL-6和TNF-α的表达。表明NS1-2是PPV NS1激活NF-κB信号通路引起炎性因子表达的关键区域。综上所述,本试验证实了PPV NS1可通过TLR2、TLR7和TLR9激活NF-κB信号通路引起细胞炎性因子的表达,而NS1-2是PPV NS1起关键作用的结构域。本试验的研究结果为深入了解PPV与宿主相互作用机制及效应,开发抗PPV病毒药物和有效疫苗提供了重要的理论依据,具有一定的应用前景。