牛磺胆酸(Taurochenodeoxycholic Acid,TCA)作为胆汁酸的主要成分之一,可以通过不同信号通路产生抗炎免疫调节作用。本研究旨在深入探讨TCA与胆汁酸膜受体(TGR5受体)的关系;TCA降低TGR5受体介导的NR8383细胞分泌TNF-α(tumor necrosis factor-ɑ)和Il-1β(interleukin-1β),也可通过Gɑq-PKC(protein kinase C)-ERK(extracellular regulated protein kinases)信号转导通路的影响二者的分泌。具体研究内容如下:(1)TCA与TGR5的相互作用的研究将成功构建的含人TGR5(简称h TGR5)真核表达载体瞬时转染至HEK-293T细胞,采用荧光显微镜检测施加50μM TCA后,HEK-293T细胞膜上含h TGR5受体的绿色荧光标签(green fluorescent protein,GFP)的变化,发现TCA能够使GFP发生内现陷;采用MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-y1)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)法测定不同浓度10000μM、1000μM、100μM、10μM、1μM、0.1μM的TCA对HEK-293T细胞的毒性作用,结果显示10000μM TCA对HEK-293T细胞的抑制率为85%,TCA给药范围应≤1000μM;采用ELISA法(Enzyme linked immune sorbent assay)测定不同浓度TCA对含h TGR5的HEK-293T细胞产生的c AMP含量的影响,结果表明不同浓度的TCA均使c AMP含量呈非线性剂量依赖性增加(P<0.05),TCA的半数有效浓度(concentration for 50%of maximal effect,EC50)=502μM,量效曲线表明,TCA促使c AMP含量增加,但其效价强度不及牛磺石胆酸(lithocholic acid,TLCA)。结论为TCA能够激动TGR5受体。(2)TCA对TGR5受体介导的NR8383细胞TNF-α和IL-1β的影响采用RT-q PCR技术、western blotting技术测定了不同浓度1000μM、500μM、100μM、50μM、10μM TCA对NR8383细胞TGR5基因、蛋白含量的影响,结果表明,不同浓度梯度的TCA对TGR5基因、蛋白水平含量变化均无显著影响(P>0.05),且NR8383细胞整体表达TGR5含量水平较低。TCA作用于转染p CMV-h TGR5表达载体的NR8383细胞,建立NR8383-TGR5稳定表达细胞系(本实验室已构建好并经过RT-q PCR、westernblot方法鉴定稳定表达h TGR5的NR8383细胞)。采用ELISA法测定了TCA对NR8383-TGR5细胞c AMP含量的影响,结果表明,与NR8383细胞空白组相比,10μM TCA使NR8383-TGR5细胞c AMP含量显著升高(P<0.05),表明NR8383细胞系中表达了TGR5受体。采用共聚焦显微镜观察了NR8383细胞中的TGR5受体,结果显示,含h TGR5位于质膜,符合TGR5为膜受体的特征。TCA作用于NR8383细胞和NR8383-TGR5细胞后,两种细胞互为对照,有助于研究TGR5在TCA对NR8383细胞产生作用时的功能,为后续应用NR8383-TGR5细胞开展相关试验奠定基础。TNF-α、IL-1β均为抗炎免疫相关的细胞因子,测定两者含量对于进一步探讨TCA作用于NR8383细胞后的抗炎免疫调节作用奠定试验基础。采用RT-q PCR技术、ELISA技术测定了1000μM、100μM、10μM TCA对NR8383细胞和NR8383-TGR5细胞产生TNF-α含量和IL-1β含量的影响,结果表明,LPS(lipopolysaccharide)诱导TNF-α含量增加(P<0.05),IL-1β基因水平含量增加(P<0.05)。1000μM TCA可极显著降低NR8383细胞TNF-α基因、蛋白和NR8383-TGR5细胞的TNF-α基因水平(P<0.01),不同浓度的TCA均可极显著减少LPS刺激的NR8383-TGR5细胞TNF-α蛋白水平(P<0.01);未经LPS处理的NR8383-TGR5细胞产生TNF-α的含量较NR8383细胞高,TGR5含量增加亦能升高NR8383细胞中TNF-α的含量(P<0.05)。经LPS刺激后,1000μM的TCA能显著增加NR8383细胞的IL-1β蛋白含量(P<0.05),而100μM的TCA则可极显著的降低IL-1β蛋白含量(P<0.01)。与NR8383-TGR5细胞空白对照组相比,1000μM和10μM TCA均可显著升高NR8383-TGR5细胞IL-1βm RNA和蛋白含量(P<0.05),但LPS刺激NR8383-TGR5细胞产生IL-1β蛋白含量变化不明显(P>0.05),却可使NR8383-TGR5细胞产生IL-1β基因显著增加(P<0.01),100μM和10μM TCA均可降低LPS刺激后IL-1βm RNA和蛋白含量(P<0.05)。(3)TCA对Gαq-PKC–ERK通路的影响在开展TCA对TGR5受体介导的NR8383细胞分泌TNF-α、IL-1β研究的基础上,为了进一步探讨TCA作用后的Gɑq(鸟苷酸蛋白的一种亚型)的表达量是否与TGR5受体(鸟苷酸蛋白偶联受体,GPCR)及其介导的相关信号通路有关,开展了本研究。采用RT-q PCR技术、western blotting技术测定1000μM、100μM、10μM M TCA对NR8383细胞和NR8383-TGR5细胞Gɑq含量的影响。结果表明,不同浓度的TCA均可显著减少NR8383细胞和NR8383-TGR5细胞Gɑq含量(P<0.05),但对比NR8383细胞和NR8383-TGR5细胞产生的Gɑq含量无统计学差异(P>0.05),表明TCA可减少Gɑq但与TGR5无关(P>0.05)。通过阻断Gɑq研究了TCA对其下游因子PKC含量的影响。采用RT-q PCR技术、western blotting技术测定1000μM、500μM、100μM TCA对NR8383细胞PKC基因、蛋白水平及p PKC蛋白水平含量的影响。与空白对照组相比,结果显示,PLC抑制剂U73122可显著减少NR8383细胞产生PKC m RNA,蛋白和p PKC含量(P<0.01),500μM TCA可显著减少LPS刺激的PKC和p PKC含量(P<0.01);与U73122对照组相比,500μM TCA可显著降低经LPS和U73122刺激的PKC和p PKC含量,100μM TCA反而可显著增加PKC和p PKC含量(P<0.01),上述结果表明TCA调节PKC及p PKC含量与Gɑq有关。应用PKC阻断剂G?6983研究了TCA对其下游信号分子ERK和p ERK含量的影响。采用q PCR技术、western blotting技术测定1000μM、500μM、100μM TCA对NR8383细胞ERK基因、蛋白水平及p ERK蛋白水平含量的影响,研究发现PKC抑制剂G?6983可显著减少NR8383细胞产生ERK、p ERK含量(P<0.01),LPS显著减少ERK含量但显著增加p ERK含量(P<0.01);不同浓度的TCA均可显著降低在LPS作用后的ERK和p ERK含量(P<0.01);与G?6983对照组相比,TCA可显著减少经LPS和G?6983作用的ERK及p ERK含量(P<0.01),但1000μM TCA可增加经G?6983和LPS作用的p ERK含量(P<0.01),上述结果表明,PKC参与TCA对ERK和p ERK含量的调节作用。通过ERK阻断剂PD98059阻断ERK研究了TCA对其下游因子TNF-α和IL-1β含量的影响,采用RT-q PCR技术、ELISA技术测定1000μM、500μM、100μM TCA对NR8383细胞TNF-α和IL-1β基因、蛋白水平含量的影响。与空白对照组相比,LPS可极显著增加NR8383细胞TNF-α和IL-1β基因和蛋白含量(P<0.01);PD98059可显著减少TNF-α蛋白和IL-1βm RNA含量(P<0.01);与LPS刺激组比,1000μM M的TCA可降低LPS诱导的TNF-α含量而增加IL-1β含量(P<0.05),100μM的TCA可极显著降低LPS刺激的IL-1β含量(P<0.01);与PD98059对照组相比,不同浓度TCA对经PD98059和LPS作用的TNF-α含量和IL-1βm RNA无影响(P>0.05),可极显著增加PD98059和LPS作用的IL-1β蛋白含量(P<0.01),上述结果表明,ERK参与TCA可调节TNF-α和IL-1β的含量。TCA能够激动TGR5受体,调节NR8383细胞中TNF-α和IL-1β的含量;TCA通过调节Gɑq-PKC-ERK信号通路而影响NR8383细胞分泌TNF-α和IL-1β含量。在证明TCA能够激动TGR5受体的基础上,ERK参与TCA对TNF-α和IL-1β的调节作用。可见,100μM TCA通过调节Gɑq-PKC-ERK信号通路降低NR8383细胞分泌TNF-α和Il-1β含量。以上研究为深入揭示TCA抗炎免疫调节作用的分子机制奠定了试验基础,为寻找TCA作用的新靶点提供了新的理论依据。