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研究背景横纹肌肉瘤（rhabdomyosarcoma,RMS）是一种罕见的软组织肿瘤,多发于儿童期,虽经历了近30年的研究,但对于晚期以及转移的患者,仍然缺乏有效的治疗手段,且预后未得到明显改善。RMS的发生与骨骼肌分化异常有关,然而其确切的分子机制尚未完全阐明。因此,本课题展开了对RMS发生发展的分子机制研究,以期为RMS的临床治疗提供理论依据。研究表明,微小核糖核酸（micro RNA,mi RNA）与RMS的发生密切相关,例如一些肌肉特异性mi RNA,如mi R-1、mi R-206、mi R-133a/b和mi R-29家族表达异常,都会导致RMS的发生,但其分子机制还有待于进一步阐明。无需置疑,mi RNA表达异常,应该与转录因子的调控密切相关。GATA结合蛋白4（GATA binding protein-4,GATA-4）属于转录因子GATA家族成员之一,我们课题组前期研究发现,GATA-4能够调控一些mi RNA的表达,并促进成肌细胞的增殖和分化,但在由骨骼肌分化障碍所致RMS发生中的作用,目前尚未阐明。除了转录因子GATA-4,能够调控mi RNA表达的还有多梳蛋白家族（Polycomb group,Pc G）,它们是抑制基因表达的调控因子,Zeste基因增强子同源物2（Enhancer of zeste homolog 2,EZH2）作为其重要成员之一,可通过使组蛋白H3上第27位赖氨酸来发生三甲基化修饰从而抑制基因的表达。另外,EZH2还可使GATA-4蛋白第299位赖氨酸发生甲基化修饰,从而抑制GATA-4的转录活性,但二者在RMS发生中的作用机制尚未阐明。我们课题组前期研究发现,在成肌细胞C2C12中,GATA-4可招募Polycomb家族成员EZH2结合在mi R-29a启动子区,以抑制mi R-29a的表达,而mi R-29a表达的抑制,促进了其靶向基因cyclin D2的表达,因而促进C2C12细胞的增殖。但在C2C12向骨骼肌分化中,GATA-4与EZH2则不能结合在mi R-29a的启动子区,从而消除了对mi R-29a的抑制作用。那么,为什么在骨骼肌分化中GATA-4不与EZH2结合?这种不结合是否与辅助激活因子有关?又在RMS发生中发挥什么作用?研究表明,谷氨酸受体相互作用蛋白1（Glutamate receptor interacting protein-1,GRIP-1）在骨骼肌分化中被诱导激活,作为一种核受体辅助激活因子,它可以与核受体结合,也可结合其它辅助因子,如组蛋白乙酰转移酶CBP/p300、甲基转移酶CARM1和G9a,以形成蛋白复合体激活转录。鉴于与GRIP-1结合的p300也可被GATA-4招募,因此我们推测GATA-4可能与GRIP-1结合,也许是这种结合导致了GATA-4与EZH2的不结合,那么,这种结合在骨骼肌分化及分化障碍所导致的RMS中发挥什么作用?这正是本课题的研究目的。研究目的本研究旨在揭示EZH2/GRIP-1和GATA-4的结合对mi R-29a的调控及其在骨骼肌分化与RMS发生中的作用,以期阐明RMS发生的分子机制。研究方法1.诱导成肌细胞C2C12向骨骼肌分化,通过Real-time PCR实验检测GATA-4和mi R-29a的表达。2.诱导成肌细胞C2C12向骨骼肌分化,通过Western blot实验检测GRIP-1的表达,免疫共沉淀实验检测EZH2、GRIP-1与GATA-4的结合,并分析分化第5天GATA-4与GRIP-1之间是否存在相互结合。通过Ch IP实验分析GATA-4和GRIP-1在mi R-29a启动子区的富集。3.在RMS细胞株（RH30、RH28、RH41、RD和RH18）和人骨骼肌细胞（human skeletal muscle cell,HSKMC）中,通过Real-time PCR分析mi R-29a的表达,并在RH30细胞中通过Luciferase assay分析EZH2、RING1b、BMI1和GATA-4对mi R-29a启动子转录活性的调控,Ch IP实验分析GATA-4、EZH2、RING1b、BMI1、H3K27me3和H3K9me3在mi R-29a启动子区的富集。在HSKMC细胞中通过Ch IP实验分析GATA-4、EZH2、RING1b、BMI1、GRIP-1、H3K27me3、H3K9me3在mi R-29a启动子区的富集,以及通过Luciferase assay分析EZH2、RING1b、BMI1、GRIP-1和GATA-4对mi R-29a启动子转录活性的调控。4.诱导RH30细胞向骨骼肌分化,通过Real-time PCR实验检测mi R-29a的表达,Ch IP实验分析GATA-4、EZH2、RING1b、BMI1、GRIP-1、H3K27me3、H3K9me3在mi R-29a启动子区的富集。5.在RH30细胞中过表达mi R-29a,诱导其向骨骼肌分化,在分化第5天,通过免疫荧光实验分析肌节球蛋白重链（sarcomeric myosin heavy chain,s MHC）的表达,Real-time PCR实验检测成肌分化因子1（myogenic Differentiation 1,myo D1）、肌细胞生成素myogenin、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子P21和细胞周期蛋白cyclin D1的表达,MTT实验检测过表达mi R-29a后RH30细胞的增殖能力。6.裸鼠成瘤实验。在RH30细胞中过表达mi R-29a,取1×10~7个处于对数生长期的上述细胞及对照细胞（转染空载体）,在BALB/C裸鼠的左腋部进行皮下注射,检测移植瘤的生长情况,根据公式1/2×长径×短径~2计算肿瘤的体积,28天后取材,拍照小鼠荷瘤情况,剥出肿瘤组织,拍照并称重分析,将肿瘤组织一分为二,一份用于免疫组化分析Ki67和磷酸化H3蛋白的表达,另一份用于Real-time PCR实验分析myogenin、myo D1、P21和cyclin D1的表达。研究结果1.在成肌细胞C2C12向骨骼肌分化中,GATA-4和mi R-29a的表达都上调。2.在成肌细胞C2C12向骨骼肌分化中,GRIP-1与EZH2竞争与GATA-4结合,EZH2从mi R-29a启动子区脱离,GRIP-1取而代之,与GATA-4共同结合在mi R-29a启动子区,从而激活mi R-29a的表达,最终促进C2C12细胞向骨骼肌分化。3.在RMS细胞RH30中,GATA-4和EZH2仍结合在mi R-29a启动子区,从而抑制mi R-29a的表达。但在彻底分化为骨骼肌的人骨骼肌细胞HSKMC中,GRIP-1和GATA-4结合在mi R-29a启动子区,从而激活mi R-29a的表达。4.mi R-29a在RMS中发挥抑制增殖并促进其向骨骼肌分化的作用。结论在骨骼肌分化中,GRIP-1与EZH2竞争与GATA-4结合,从而激活mi R-29a的表达,最终促进骨骼肌分化,但在RMS发生中,GATA-4和EZH2仍结合在mi R-29a启动子区,从而抑制mi R-29a的表达,而mi R-29a则抑制RMS的增殖并促进其向骨骼肌分化。