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脂联素（Adiponectin，APN）是脂肪组织分泌的一种特异性蛋白质，是一个重要的代谢调节因子，具有调节糖脂代谢、抗炎症、抗纤维化、抗动脉粥样硬化的功能、改善胰岛素抵抗的功能。近年来研究表明脂联素还是一种重要的心血管功能调节因子，对心肌缺血再灌注损伤具有保护作用，但其具体机制尚有待深入研究。本研究采用分子生物学及细胞生物学手段，观察脂联素对大鼠心肌缺血再灌注损伤保护作用，并通过对内质网应激及肌浆网钙泵相关指标进行检测，探讨其机制。分以下三个部分：实验一脂联素对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用目的：制备大鼠心肌缺血再灌注损伤模型，观察球形脂联素对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用。方法：健康雄性SD大鼠随机分为假手术组(sham)、缺血再灌注组（I/R）和I/R+球形脂联素（globular Adiponectin，gAd）组（I/R+gAd），每组各16只大鼠。假手术组：只穿线，不结扎，旷置225min；I/R组：冠状动脉前降支结扎45min后，再灌注180分钟； I/R+gAd组：于再灌注前10分钟经舌静脉给予脂联素。再灌注结束后对各组大鼠血流动力学指标进行检测、监测大鼠Ⅱ导联心电图，测定心肌酶。实验结束后，取左心室游离壁及心尖部心肌组织，观察心肌超微结构，TUNEL法及Caspase-3活性测定评估心肌细胞凋亡，并用Evans blue-TTC双染法测定心肌梗死面积。结果：与Sham组相比，I/R组LVEDP升高、+dp/dt max和-dp/dt max降低(P＜0.05)；心律失常发生率和死亡率明显增加(P＜0.05)；心肌梗死面积增大(P＜0.05)；心肌超微结构改变；心肌细胞LDH活性、CK-MB活性显著升高(P＜0.01)； caspase-3活性升高(P＜0.01)、TUNEL法结果显示TUNEL染色阳性心肌细胞明显增多(P＜0.01)。与I/R与相比，gAd预处理可显著改善血流动力学(P＜0.05)、减少心律失常和死亡的发生(P＜0.05)、降低LDH、CK-MB活性(P＜0.05)、减少TUNEL阳性染色细胞(P＜0.05)，减少caspase-3活性(P＜0.05)。结论：球形脂联素对大鼠心肌缺血再灌注损伤有保护作用。实验二脂联素对心肌细胞缺氧复氧损伤的保护作用及机制研究（一）脂联素对乳鼠心肌细胞缺氧复氧损伤的保护作用目的：采用离体乳鼠心肌细胞缺氧复氧模型模拟在体心肌缺血再灌注损伤，观察不同剂量脂联素对心肌细胞缺氧复氧损伤的保护作用。方法：原代培养乳鼠心肌细胞，建立缺氧复氧模型，随机分为6组：1.对照组（control）2. gAd组（2μg/ml）3. H/R组缺氧3小时，复氧6小时4. H/R+gAd（0.5μg/ml）5. H/R+gAd（1μg/ml）6. H/R+gAd（2μg/ml）观察心肌细胞形态学变化；检测心肌细胞LDH含量；检测确定心肌细胞凋亡；结果：与control组相比，H/R组细胞形态学发生改变， LDH、CK-MB含量升高(P＜0.01)、TUNEL法及Caspase3结果显示，H/R组凋亡细胞显著增加(P＜0.01)；gAd（2μg/ml）显著减少H/R诱导的心肌细胞损伤（P＜0.05)。结论：gAd剂量依赖性的减轻H/R诱导的心肌细胞损伤；（二）脂联素通过抑制内质网应激减轻心肌细胞缺氧复氧损伤目的：利用离体乳鼠心肌细胞H/R模型，揭示脂联素是否通过抑制内质网应激减轻心肌缺氧复氧损伤。方法：原代培养乳鼠心肌细胞，随机分为7组：1.对照组2. gAd组3. H/R组4. H/R+gAd组5. H/R+4-苯基丁酸（H/R+4-PBA）组4-PBA，ERS的经典保护剂6.毒胡萝卜内酯（thapsigargin，TG)组，TG，通过抑制肌浆网钙泵活性诱导ERS，是ERS的特异性诱导剂7. TG+gAd组采用RT-PCR法及Western blot法测定内质网应激（Endoplasmic ReticulumStress，ERS）相关指标GRP78、CHOP和caspase-12mRNA和蛋白的表达，评估ERS的激活。结果：（1）与control组相比，H/R组心肌细胞ERS相关指标GRP78、CHOP和caspase-12mRNA及蛋白的表达显著升高(P＜0.01)，并可被ERS特异性保护剂4-PBA所逆转(P＜0.01)，提示H/R诱导心肌细胞ERS。gAd抑制H/R诱导的GRP78、CHOP和caspase-12mRNA及蛋白的上调（P＜0.05)。与control组相比，H/R组心肌细胞LDH活性和caspase-3活性均显著增加(分别P＜0.01)，TUNEL染色阳性细胞明显增加(P＜0.01)，gAd可以明显抑制心肌细胞H/R损伤（P＜0.05)，提示gAd对H/R损伤的保护，至少部分通过抑制ERS。（2）与control组相比，TG组心肌细胞ERS相关指标GRP78、CHOP和caspase-12mRNA及蛋白的表达显著升高(P＜0.01)；心肌细胞LDH活性和caspase-3活性均显著增加(分别P＜0.01)，TUNEL染色阳性细胞明显增加(P＜0.01)。gAd可以抑制TG诱导的ERS及心肌细胞损伤（P＜0.05)，证实gAd直接抑制ERS。结论：gAd对H/R损伤的保护，至少部分通过抑制ERS。（三）脂联素通过对肌浆网钙泵活性的保护抑制内质网应激目的：利用离体乳鼠心肌细胞H/R模型，观察脂联素对肌浆网钙泵(sarco/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase，SERCA)活性的影响。方法：原代培养乳鼠心肌细胞，细胞处理分组同（二），检测肌浆网钙泵（SRCa2+-ATPase, SERCA）相关指标。结果：（1）与control组相比，H/R组心肌细胞SERCA活性下降(P＜0.01)，受磷蛋白（phospholamban，PLN）磷酸化(P＜0.05)，SERCA蛋白表达未见明显变化，细胞质[Ca2+]i明显升高(P＜0.01)；与H/R组相比，gAd逆转H/R对SERCA活性的过度抑制(P＜0.01)，受磷蛋白磷酸化进一步加强(P＜0.05)，钙超载减轻(P＜0.05)。（2） gAd逆转TG（特异性SERCA抑制剂）诱导的SERCA活性抑制(P＜0.05)，进一步证实gAd对SERCA具有保护作用。结论：gAd减轻ERS可能与上调SERCA活性有关。（四）脂联素通过PI3K/Akt通路调节肌浆网钙泵活性及内质网应激目的：通过乳鼠原代心肌细胞培养，给予缺氧复氧损伤，探讨脂联素调节内质网应激和SERCA活性的作用是否与PI3K/Akt信号通路有关。方法：原代培养乳鼠心肌细胞，随机分为6组：1.对照组（control）2. gAd组3. H/R组4. H/R+gAd5. H/R+LY294002组复氧开始时给予LY294002（特异性PI3K/Akt抑制剂）6. H/R+LY294002+gAd组采用western blot法检测Akt活化程度；RT-PCR法及Western blot法测定ERS相关指标GRP78和CHOP mRNA和蛋白的表达，测定SERCA活性。结果：（1）与control组相比，H/R组心肌细胞p-Akt/Akt比值升高(P＜0.05)；脂联素可以进一步加强Akt磷酸化(P＜0.05)。预先给予PI3K/Akt通路特异性阻断剂LY294002可阻断gAd对Akt的作用(P＜0.05)，提示H/R损伤时，gAd可激活PI3K/Akt信号转导通路。（2） gAd抑制H/R诱导的ERS(P＜0.05)，预先给予LY294002，可阻断gAd对ERS的保护作用(分别P＜0.05)。（3）gAd改善H/R诱导的SERCA活性抑制(P＜0.01)，预先给予LY294002，可阻断gAd对SERCA活性的保护作用(P＜0.05)。结论：PI3K/Akt信号通路参与gAd对内质网应激和SERCA活性的调节。实验三脂联素保护大鼠心肌缺血再灌注损伤的机制研究目的：在体研究gAd保护心肌缺血再灌注损伤的机制。方法：（1）建立大鼠心肌缺血再灌注模型，随机分为5组：1.假手术组（sham）2. I/R组3. I/R+gAd组4. I/R+LY294002组5. I/R+LY294002+gAd组采用western blot法测定心肌I/R时p-Akt、Akt蛋白；RT-PCR及western blot法测定内质网应激相关指标GRP78、CHOP和caspase-12mRNA及蛋白表达；测定SERCA活性。结果：（1）与sham组相比，I/R组p-Akt/Akt比值升高(P＜0.05)，gAd进一步加强Akt激活(P＜0.05)；预先给予PI3K特异性抑制剂LY294002可逆转Akt激活(P＜0.05)，提示I/R过程中，gAd可以激活PI3K/Akt信号转导途径；（2）与sham组相比，I/R组心肌细胞ERS相关指标GRP78、CHOP和caspase-12mRNA及蛋白的表达显著升高(P＜0.01)，提示心肌I/R损伤可以诱导ERS。gAd抑制I/R诱导的GRP78、CHOP和caspase-12mRNA及蛋白的表达上调（P＜0.05)。（3）与sham组相比，I/R组心肌细胞SERCA活性显著下降(P＜0.01)；gAd可上调I/R诱导的SERCA活性抑制(P＜0.01)；（4）与I/R组相比，gAd预处理可以诱导Akt磷酸化（P＜0.05)，预先给予LY294002，可以消除gAd对Akt的激活（P＜0.05)。（5）与I/R+gAd组相比，预先给予LY294002可减弱gAd对SERCA活性及ERS的保护作用(P＜0.01或P＜0.05)。结论：（1）gAd减轻大鼠心肌I/R诱导的ERS；（2）gAd保护大鼠心肌I/R时SERCA活性；（3）心肌缺血再灌注过程中，gAd激活PI3K/Akt信号转导途径；（4）gAd改善心肌I/R时SERCA的活性及内质网应激，其机制可能与激活PI3K/Akt信号通路有关。