研究背景创伤性脑损伤(traumatic brain injury,TBI)发病率,致死率及致残率高,给社会带来极大的负担。根据TBI病理生理过程分为原发性损伤和继发性损伤。原发性损伤在损伤后立即导致脑组织挤压变形,脑血流中断或者改变、神经元和胶质细胞毁损而死亡,这些损伤无法通过临床措施实施干预,只能加强预防。继发性损伤在原发性损伤后立即开始直至持续数月,局部神经化学变化引起一系列生化改变,细胞损伤与修复,增殖与凋亡,代谢改变相互作用进而出现细胞生命终结事件。继发性脑损伤的病理生理机制复杂,深入理解影响脑损伤的病理因素,对于TBI的病理理解及治疗将会带来新的启示。研究证实自然界哺乳动物血压、神经内分泌激素分泌、睡眠觉醒周期、体温、尿量变化、褪黑素及生长因子、进食等各种生理、生化、代谢过程都遵循着大约24小时的周期性变化,称为昼夜节律(circadian rhythms)。昼夜节律是各种生物对环境因素循环变化长期适应和演化的结果,其广泛存在各种有机生命中,是自然界中重要的生命现象。昼夜节律基因调控包括神经干细胞在内的多种细胞增殖,参与修复重建、参与细胞周期进程、影响神经递质释放及神经可塑性。目前越来越多的流行病学和遗传学数据显示昼夜节律紊乱与多种疾病发生、发展及药物治疗效果密切相关,这些疾病包括认知功能障碍、痴呆及帕金森、心血管系统心绞痛、脑血管意外发生、代谢综合征及胰岛素抵抗、乳腺癌及药物治疗抵抗等。在脑损伤后患者面临环境及病理损坏的影响,昼夜节律紊乱经常发生。动物实验及临床研究表明脑损伤后昼夜节律基因表达失衡,因此我们推测昼夜节律调控大脑神经功能,参与病理损伤过程,但是如何参与及潜在的病理机制尚不明确;同时研究发现昼夜节律参与细胞周期进程,影响胰岛素,糖皮质激素及抗肿瘤药物的药物空间分布及药理效果。在神经保护治疗措施中,神经生长因子(nerve growth factor,NGF)能够促进神经细胞生长、分化,促进损伤细胞修复,NGF发挥生物学效应必须经过其自身特异性受体介导,迄今主要发现两种NGF受体:高亲和力受体(Trk A)和低亲和力受体(p75)。NGF与高亲和力受体Trk A结合,发挥正性调节作用,维持神经元生长、发育、分化,促进损伤神经元修复;与低亲和力受体p75结合发挥负性调节作用,诱导细胞凋亡。研究发现Trk A和p75在脑组织中的表达受到昼夜节律的调控,呈现24h节律模式。但是在昼夜节律紊乱环境下,对NGF治疗影响鲜见报道,我们提出假设在脑损伤状态下昼夜节律紊乱影响Trk A、p75受体表达进而影响NGF治疗效果。因此本研究将探讨昼夜节律紊乱对大鼠脑损伤病理改变及对NGF治疗效果的影响。我们首先建立大鼠脑损伤动物模型,采用灯光持续照射导致大鼠昼夜节律紊乱,连续干扰14天,观察大鼠行为学、学习记忆能力的变化,观察对细胞生存及神经再生的影响;在脑损伤昼夜节律紊乱的基础上给与NGF治疗,检测NGF受体表达及凋亡信号基因蛋白改变,明确星形胶质细胞及小胶质细胞在昼夜节律紊乱下对炎症因子分泌的影响。本研究为通过外界环境影响脑损伤的预后,为我们临床治疗提供新的思路,同时也对NGF治疗效果优化有重要启示。第一部分昼夜节律紊乱对大鼠脑损伤病理改变的影响目的:观察昼夜节律紊乱对脑损伤病理改变及海马神经再生的影响材料与方法:制备大鼠颅脑损伤模型,采用正常明暗环境(Light/Dark,LD)和灯光持续照射(Light/Light,LL)两种环境模式(即正常昼夜节律与昼夜节律紊乱),连续干预14天。实验大鼠随机分为4组:正常对照组(Sham/LD)、昼夜节律紊乱对照组(Sham/LL)、脑损伤/正常昼夜节律组(TBI/LD)、脑损伤/昼夜节律紊乱组(TBI/LL),造模后采用Brdu50mg/kg连续注射7天。采用神经功能评分观察大鼠行为学改变;平衡木平衡实验及行走实验检测大鼠运动及平衡能力;水迷宫检测大鼠学习记忆能力改变;14天取脑组织标本,计算脑损伤灶体积;Nissl染色观察损伤区域周围皮质及海马区神经元生存细胞数量;采用Brdu标记新生存活细胞、Ki-67标记增殖细胞、DCX标记新生未成熟神经元细胞,免疫组化测定海马DG区14天时新生细胞存活数量、细胞增殖情况及新生未成熟神经元数量。结果:1.对比各组大鼠体重、饮水及摄食量发现,14天时与Sham/LD组相比,Sham/LL组大鼠体重、摄食量明显增加(P<0.05),饮水量无差异(P>0.05);TBI/LD组与Sham/LD组相比,体重及神经功能评分降低(P<0.05);TBI/LL组与TBI/LD组相比体重、摄食及神经功能评分均降低(P<0.05)。2.平衡木实验及水迷宫实验结果显示与Sham/LL组相比,TBI/LD组平衡运动能力降低,学习记忆能力受到明显损害(P<0.05);TB/LL组大鼠较TBI/LD组大鼠平衡能力、运动协调及认知功能进一步下降(P<0.05)。3.经Nissl染色计算损伤灶体积结果显示TBI/LL组损伤体积明显大于TBI/LD组(34.33±1.58mm3 VS 23.97±2.94mm3,P<0.05);同时TBI/LL组脑损伤区域周围及海马CA1区神经元生存数量减少,但海马DG区细胞数量无明显差异。4.脑损伤后TBI/LD组与Sham/LD组相比,海马DG区Ki-67阳性细胞数量增加,同时Brdu标记新生细胞存活数量也增加(P<0.05);TBI/LL组海马DG区Ki-67阳性细胞数量及Brdu标记新生细胞存活数量较Sham/LD组和TBI/LD组明显减少(P<0.05)。5.用DCX阳性细胞标记未成熟神经元,TBI/LD组与Sham/LD组相比,海马DG区未成熟神经元数量增加,但TBI/LL组海马DG区未成熟神经元细胞数量明显减少(P<0.05)。大鼠脑损伤后伴随昼夜节律紊乱将使其体重减轻,神经功能损害症状加重,平衡运动能力及认知能力受到损害、大鼠脑损伤体积增加,同时脑内神经元生存数量及新生神经元数量减少。结论:第二部分昼夜节律紊乱对NGF治疗影响的机制研究目的:探讨昼夜节律紊乱对NGF治疗效果的影响及分子机制材料与方法:制备大鼠颅脑损伤模型,采用正常明暗环境(Light/Dark,LD)和夜晚灯光持续照射(Light/Light,LL)两种环境模式(即正常昼夜节律与昼夜节律紊乱),连续干预14天。实验大鼠随机分为3组:正常对照组(Sham/LD)、脑损伤正常节律加NGF治疗组(TBI/LD/NGF)、脑损伤昼夜节律紊乱加NGF治疗组(TBI/LL/NGF)。NGF治疗按32ug/kg剂量肌肉注射,连续注射14天。采用神经功能评分观察大鼠行为学改变;平衡木平衡实验及行走实验检测大鼠运动及平衡能力;水迷宫检测大鼠学习记忆能力改变;实时定量PCR大鼠脑组织中NGF受体Trk A和p75(NTR)通路相关基因AKT、NTRAK1、NFKβ、BCL-2、BAX、JNK、Caspase-3 m RNA在转录水平的相对表达;Westernblot测定NGF受体信号通路Trk A、p75(NTR)、JNK、Caspase-3、AKT、NFKβ、NCo R、PARP蛋白含量;免疫荧光观察Trk A、p75(NTR)受体表达及星形胶质细胞增殖、小胶质细胞活化情况;TUNEL法检测脑损伤区域凋亡细胞数量;Elisa法检测炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-β在血清和脑组织中的含量。结果:1.对各组大鼠神经功能评分及平衡木实验结果显示,TBI/LL/NGF组大鼠神经功能损害恢复明显延迟于TBI/LD/NGF组,损伤后14天时平衡木平衡时间明显缩短,同时行走时间延长(P<0.05)。2.水迷宫试验中,定位巡航阶段,TBI/LL/NGF组由于昼夜节律紊乱,潜伏期延长,学习能力低于TBI/LD/NGF组(P<0.05);在空间探索阶段,TBI/LD/NGF组空间探索时间及穿越平台次数明显多于TBI/LL/NGF组(P<0.05)。3.实时定量PCR显示TBI/LD/NGF组在昼夜节律正常情况下NGF高亲和力受体Trk A、及细胞生长、分化相关基因AKT、NTRAK1、NFKβ、BCL-2表达增高,低亲和力p75及凋亡相关基因BAX、JNK、Caspase-3表达降低;相反在昼夜节律紊乱条件下Trk A、AKT、NTRAK1、NFKβ、BCL-2表达降低,p75及凋亡相关基因BAX、JNK、Caspase-3表达呈增高趋势。同时Westernblot结果也与m RNA表达相一致。4.免疫荧光发现在TBI/LD/NGF组Trk A受体阳性细胞明显多于TBI/LL/NGF组(P<0.05),但是p75(NTR)阳性细胞少于TBI/LL/NGF组(P<0.05)。TUNEL染色显示TBI/LD/NGF组凋亡细胞数量明显少于TBI/LL/NGF组(P<0.05)。5.免疫荧光对GFAP阳性星形胶质细胞标记显示在TBI/LL/NGF组星形胶质细胞反应性增生明显多于TBI/LD/NGF组(TBI/LL/NGF:466.90±65.10/field VS339.56±48.37/field,P<0.05);同时由于昼夜节律紊乱小胶质细胞活化也呈增多趋势(TBI/LL/NGF:115.60±23.62/field VS 65.40±12.55/field,P<0.05)。6.在血清及脑组织中炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-β分泌TBI/LL/NGF组也明显高于TBI/LD/NGF组(P<0.05)。结论:在昼夜节律紊乱条件下,NGF对脑损伤治疗作用下降。与NGF在正常节律条件下相比,神经功能障碍及认知损害加重、细胞凋亡数目增多、炎症因子释放增加,可能与昼夜节律紊乱后激活低亲和力受体p75介导凋亡信号通路表达有关。