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背景:糖尿病脑病(Diabetic Encephalopathy,DE)是糖尿病(Diabetes Mellitus,DM)引起的中枢神经病变,主要表现为学习、记忆等认知功能的障碍。长期以来其机制仍未阐明,缺乏特异有效的治疗方法。由此,明确其发病机制,寻找有效的药物治疗靶点,是目前DE研究中亟需解决的关键临床问题之一。近年发现,DE表现的认知功能障碍与突触可塑性密切相关,主要通过影响突触前膜的神经递质释放、突触后膜谷氨酸受体功能和分布等最终引起长时程增强(Long-term potentiation,LTP)减低及长时程压抑(Long-term depression,LTD)增强,导致认知功能减退。但诱发这些突触可塑性变化的内在机制尚不明确。肌动蛋白作为一种细胞骨架成分,是维持突触形态的基础。丝切蛋白(cofilin)是一种能快速调节肌动蛋白纤维聚合或解聚的肌动蛋白结合蛋白。LIM 激酶 1(LIM-domain containing protein kinase 1,LIMK1)蛋白可通过磷酸化调节细胞骨架的形成,在调控神经元形态及突触生长中有重要地位。而且,Limk/Cofilin通路可影响LTP诱导后突触α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole-propionic acid receptor,AMPA)受体的积累和运输参与调节突触可塑性。磷脂酸磷酸酶Lipin1是Lipin蛋白家族的一员,是一种和糖脂代谢密切相关的基因。Lipin1表达的改变、基因的变异与胰岛素抵抗、2型糖尿病的发生均有关。其生理功能主要依赖磷脂酸磷酸酶(phosphatidic acid phosphatase,PAP)的活性,能够使磷脂酸(phosphatidic acid,PA)生成甘油二酯(diacylglycerol,DAG),DAG 可使蛋白激酶 D(protein kinases D,PKD)发生磷酸化参与肌动蛋白重组和肌动蛋白细胞骨架驱动的细胞定向迁移过程。另外PKD在神经元发育早中晚期均有重要作用。我们推测Lipin1可通过影响DAG含量调控PKD介导的信号通路。研究表明在Lipin1缺乏的脂肪肝营养不良(fatty liver dystrophy,fld)小鼠中出现了周围神经系统病变及认知功能障碍,我们也发现在糖尿病周围神经病变(Diabetic peripheral neuropathy,DPN)及DE大鼠海马CA1区lipin1表达下降。基于此,我们通过分子生物学技术,探讨Lipin1是否通过PKD/Limk/Cofilin信号通路调节突触可塑性参与了 DE的发病过程。第一部分Lipin1对不同糖浓度下PC12细胞活性的影响目的:观察在不同糖浓度下PC12细胞活性;观察感染慢病毒上调、下调Lipin1表达后PC12细胞的活性。方法:1.应用CCK-8试剂盒检测PC12细胞在不同糖浓度(25、50、75、100、125、150mmol/L)下培养24h、48h活性。25mmol/L为对照正常糖浓度。2.电镜、Hoechst 33342染色观察对照、高糖组PC12细胞形态变化。3.检测对照、高糖组PC12细胞Lipin1mRNA、蛋白表达的差异。4.将Lipin1沉默、过表达及空载体慢病毒(Lv-Lipin1 ShRNA、Lv-Lipin1 ShRNA-Con、Lv-Lipin1、Lv-Lipin1-Con)感染 PC12 细胞并验证感染效率。5.将细胞分组为高糖+Lv-Lipin1组、高糖+Lv-Con组、正糖+Lv-Lipin1 ShRNA组、正糖+Lv-Con组。CCK-8检测各组细胞活性。结果:1.与对照组相比,细胞活性在100mM/48h(P<0.01)条件下比在75mM/48 h(P<0.05)条件下差异更大,所以选择25mmol/48h为正常对照组条件(normal glucose,NG),100mM/48h为高糖组条件(high glucose,HG)用于后续实验。2.HG组细胞较NG组凋亡增加。3.HG组细胞Lipin1 mRNA及蛋白的表达较NG组减少(P<0.01)。4.与 HG+Lv-Con 组相比,HG+Lv-Lipin1 组细胞活性增加(P<0.01);与 NG+Lv-Con组相比,NG+Lv-Lipin1 ShRNA组细胞活性降低(P<0.01)。结论:1.PC12细胞活性与糖浓度及时间呈负相关,且细胞活性降低同时伴随着Lipin1表达的减少。2.Lipin1过表达可有效改善高糖诱导下PC12细胞活性的降低;而沉默Lipin1后细胞在正糖条件下活性降低。第二部分Lipin1在糖尿病脑病大鼠认知功能障碍中的作用机制研究目的:探讨Lipin1是否通过PKD/Limk/Cofilin信号通路调节突触可塑性参与DE的发病过程。方法:1.构建DE大鼠模型。2.检测正常(wild type,WT)、DE组大鼠CA1区Lipin1 mRNA、蛋白表达的差异。3.Lipin1慢病毒立体定位注射大鼠海马CA1区。分组为WT+Lv-Lipin1 ShRNA(WT+Lipin1 沉默组)、WT+Lv-Con(WT+Lipin1 沉默空载体组)、DE+Lv-Lipin1(DE+Lipin1过表达组)、DE+Lv-Con(DE+Lipin1过表达空载体组),并行行为学实验,检测各组大鼠认知功能的变化。4.电镜、高尔基染色观察各组大鼠CA1区神经元突触数量及树突棘的变化。5.检测各组大鼠 CA1 区 DAG 水平,p-Ssh1、p-PKD、p-Limk1、p-Cofilin 和 Syn蛋白表达量。结果:1.注射STZ第3天起,与WT组大鼠相比,DM组血糖升高(P<0.01),体重下降(P<0.01)。2.Morris水迷宫实验提示注射STZ 12周后,DM组较WT组大鼠认知功能下降。3.与WT组大鼠相比,DE组Lpin1 mRNA(P<0.01)、蛋白(P<0.01)表达水平减少。4.旷场实验及新物体实验中,与WT+LV-Con组大鼠相比,DE+LV-Con(P<0.01)和WT+LV-Lipin1 ShRNA组(P<0.05)在中心区域活动时间及分辨指数(Discrimination index,DI)减少。DE+LV-Lipin1组在中心区域活动时间及DI高于DE+LV-Con组(P<0.05)。Morris水迷宫实验中,定位航行期第3天(P <0.01)、4天(P<0.05),DE+LV-Con组逃避潜伏期比WT+LV-Con组增加;与DE+LV-Con组相比,DE+LV-Lipin1组的逃避潜伏期减少。WT+LV-Lipin1 ShRNA组与WT+LV-Con组差异无统计学意义。在空间探索期,DE+LV-Con和WT+LV-Lipin1 ShRNA组穿越平台的次数少于WT+LV-Con组(P<0.01),DE+LV-Lipin1 组穿越平台的次数多于 DE+LV-Con 组(P<0.05)。5.与 WT+LV-C on 组大鼠相比,WT+LV-Lipin1 ShRNA 和 DE+LV-Con 组的突触数量及树突棘密度减少(P<0.01)。与DE+LV-Con组相比,DE+LV-Lipin1组突触数量及树突棘密度增加(P<0.01)。6.与 WT+LV-Con 组大鼠相比,WT+LV-Lipin1 ShRNA 组和 DE+LV-Con 组 CA1区DAG水平、P-PKD、P-Limk1、P-Cofilin、p-Ssh1和Syn蛋白表达水平下降;而DE+LV-Lipin1组的这些蛋白水平与DE+LV-Con组相比增加。差异有统计学意义。结论:1.与WT组大鼠相比,DE组大鼠CA1区Lipin1 mRNA、蛋白表达水平降低。2.沉默WT组大鼠CA1区Lipin1表达导致认知功能障碍,神经元突触及树突棘数量减少;而在DE大鼠CA1区过表达Lipin1后大鼠认知功能改善,神经元突触及树突棘数量增加。3.Lipin1在DE大鼠海马CA1区的表达发生改变,可能通过PKD/Limk/Cofilin信号通路来调节海马神经突触可塑性参与了 DE的发生。