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研究背景胃癌（gastric cancer,GC）是我国最常见的消化道肿瘤之一,因其高发病率和死亡率的特点,所以对于胃癌发生、进展和治疗新分子靶点的发现尤为迫切和重要。tRFs＆tiRNAs是近几年发现的新的小非编码RNA分子,目前已有研究发现tRFs＆tiRNAs参与了多种恶性肿瘤的进展,但其在胃癌中的研究仍然较少。研究目的1)明确胃癌高表达的tRFs＆tiRNAs分子。2)筛选出候选致癌tRFs目标分子,验证其临床病理相关性和在胃癌细胞中的生物学功能。3)探究tRFs目标分子在胃癌进展中的分子机制,为胃癌发生和进展提供了新的理论依据和治疗靶点。研究方法1.tRF-Val在胃癌中的表达及与临床病理特征的相关性1)采集4对胃癌组织和配对正常组织样本进行tRFs＆tiRNAs高通量测序分析,筛选出差异倍数最大的5个胃癌高表达的tRFs作为候选分子。2)在10对胃癌组织和配对正常组织的小样本中,对5个tRFs候选分子进行qRT-PCR验证,其中tRF-60:76-Val-CAC-2（文中简称tRF-Val）是显著性最大的tRFs分子。3)在65例胃癌组织和对照正常组织大样本中对tRF-Val表达水平进行qRT-PCR验证和临床相关性分析。4)qRT-PCR 检测 tRF-Val 在 4 种胃癌细胞系 MKN-45、MKN-28、HGC-27、AGS和永生化胃粘膜上皮细胞GES-1中的表达。2.tRF-Val在胃癌细胞中的生物学功能研究1)在胃癌细胞中构建tRF-Val敲低和过表达模型,qRT-PCR验证转染效率。2)进行体外细胞生物学实验,CCK-8实验检测细胞增殖能力,平板克隆形成实验检测细胞克隆形成能力,流式细胞术检测细胞凋亡,Transwell实验检测细胞的侵袭能力。3)进行体内细胞生物学实验,裸鼠皮下移植瘤实验检测tRF-Val敲低对肿瘤生长的影响。3.tRF-Val靶向结合EEF1A1并介导其入核1)体外合成tRF-Val生物素探针和反义链对照探针,RNA pulldown实验、质谱实验、银染实验、RNA免疫共沉淀（RNA immunoprecipitation,RIP）实验检测和验证胃癌细胞中的tRF-Val互作蛋白。2)qRT-PCR实验、核浆蛋白分离实验、Western blot（WB）实验、细胞免疫荧光（immunofluorescence,IF）实验、荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization,FISH）实验检测在胃癌细胞中tRF-Val与EEF1A1之间的调控作用。4.EEF1A1通过增强MDM2的功能促进胃癌进展1)在胃癌细胞中构建EEF1A1敲低和过表达模型,WB实验验证转染效率。2)平板克隆形成拯救实验验证过表达tRF-Val同时敲低EEF1A1对胃癌细胞生长的影响。3)平板克隆形成实验和流式细胞术检测EEF1A1敲低和过表达对胃癌细胞生长和凋亡的影响。4)免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation,Co-IP）实验验证 EEF1A1 和MDM2-p53复合物的结合,WB实验验证EEF1A1敲低和过表达对MDM2在Ser1 66位磷酸化的影响。5)核浆蛋白分离实验、WB实验验证EEF1A1敲低和过表达对MDM2、p-MDM2核定位的影响。6)泛素化检测实验验证EEF1A1过表达对p53泛素化的影响。7)WB实验验证EEF1A1敲低和过表达对p53及其下游蛋白p21、Bax、Bc12的影响。5.tRF-Val靶向结合EEF1A1调控MDM2/p53通路1)细胞IF实验验证tRF-Val对EEF1A1和MDM2共定位的影响,Co-IP实验验证tRF-Val转染浓度对EEF1A1和MDM2结合的影响。2)核浆蛋白分离实验、WB实验验证tRF-Val敲低和过表达对MDM2、p-MDM2核定位的影响。3)泛素化检测实验验证tRF-Val过表达对p53泛素化的影响。4)WB拯救实验验证在胃癌细胞中敲低、过表达tRF-Val同时过表达、敲低EEF1A1对p-MDM2、p53、p21、Bax、Bcl2 蛋白的影响。5)CCK-8和平板克隆拯救实验验证在胃癌细胞中过表达tRF-Val同时敲低MDM2对细胞增殖的影响。6)WB实验和免疫组化（immunohistochemistry,IHC）实验验证裸鼠肿瘤中tRF-Val敲低后p53、p21、Bax、Bcl2蛋白的变化。研究结果1.tRF-Val在胃癌中的表达及与临床病理特征的相关性1)高通量测序结果显示,tRFs＆tiRNAs在4对胃癌和对照正常组织中存在着差异表达,其中tRF-3a在胃癌中是主要上调的tRFs类型。2)选择变异倍数最高的5个tRF-3a类分子在10对胃癌组织中进行小样本qRT-PCR验证,tRF-Val是最显著上调的tRF分子（P=0.002）。3)tRF-Val在65例胃癌组织以及4种胃癌细胞系中均显著高表达。4)临床病理分析显示tRF-Val的表达水平与肿瘤的大小和浸润深度显著正相关（P=0.040和P=0.004）。2.tRF-Val在胃癌细胞中的生物学功能研究1)tRF-Val在AGS和MKN-45胃癌细胞中的表达量最高,利用其构建tRF-Val过表达和敲低模型,qRT-PCR结果显示tRF-Val的表达显著增加及降低。2)tRF-Val过表达显著促进胃癌细胞的增殖、侵袭,并抑制其凋亡;而tRF-Val敲低显著抑制胃癌细胞的增殖、侵袭,并促进其凋亡。3)在裸鼠移植瘤实验中tRF-Val敲低抑制胃癌肿瘤的生长。3.tRF-Val靶向结合EEF1A1并介导其入核1)RNA pulldown实验和蛋白质谱鉴定实验结果显示tRF-Val靶向结合EEF1A1;RIP实验反向验证了 EEF1A1与tRF-Val的结合。2)qRT-PCR实验结果显示,tRF-Val不影响EEF1A1在mRNA水平的表达。3)qRT-PCR实验结果显示,EEF1A1敲低、过表达不影响tRF-Val的表达。4)WB实验结果显示,tRF-Val不影响EEF1A1在总蛋白水平的表达,但是tRF-Val过表达显著增加了胞核蛋白EEF1A1的表达量而减少了胞浆蛋白EEF1A1的表达量。5)细胞IF实验结果显示tRF-Val过表达显著增强EEF1A1在细胞核内的荧光强度。6)FISH实验结果显示,tRF-Val过表达也主要显著增强tRF-Val在细胞核内的荧光强度,同EEF1A1的趋势相同。4.EEF1A1通过增强MDM2的功能促进胃癌进展1)在胃癌细胞中,tRF-Val过表达对胃癌细胞的促增殖作用,可以被EEF1A1的敲低所逆转。2)在胃癌细胞中,EEF1A1过表达显著促进胃癌细胞生长,抑制其凋亡;EEF1A1敲低显著抑制胃癌细胞生长,促进其凋亡。3)Co-IP实验结果显示在胃癌细胞中EEF1A1可以和MDM2-p53复合物结合,并促进MDM2在Ser166位点的磷酸化。4)EEF1A1过表达后可以在胃癌细胞中显著增加细胞核中MDM2和p-MDM2的表达水平。5)EEF1A1的过表达在胃癌细胞中显著提高了 p53的泛素化水平。6)EEF1A1的过表达显著降低了胃癌细胞中p53、p21和Bax蛋白的表达,并增加了Bc12蛋白的表达,而EEF1A1的敲除则显示了完全相反的结果。5.tRF-Val靶向结合EEF1A1调控MDM2/p53通路1)细胞IF实验和Co-IP实验结果显示,tRF-Val促进EEF1A1入核以及和核定位MDM2的结合。2)tRF-Val过表达后可以在胃癌细胞中显著增加细胞核中MDM2和p-MDM2的表达水平。3)tRF-Val的过表达在胃癌细胞中显著提高了 p53的泛素化水平。4)WB拯救实验结果显示,tRF-Val过表达显著增加胃癌细胞中p-MDM2和Bcl2的表达,并降低p53、p21和Bax的表达,而tRF-Val的敲低则显示出完全相反的结果。此外,tRF-Val敲低或过表达对MDM2/p53通路的调节能够分别被EEF1A1过表达和沉默所逆转。5)CCK-8和平板克隆拯救实验结果显示,tRF-Val过表达对胃癌细胞的促增殖作用,可以被MDM2的敲低显著逆转。研究结论1)tRF-Val在胃癌组织和胃癌细胞系中显著高表达,且其表达水平与肿瘤大小和浸润深度（T分期）呈显著正相关。2)tRF-Val在体内体外显著促进胃癌细胞的增殖,并抑制凋亡。3)机制上,tRF-Val靶向结合EEF1A1,并介导其转运入核,进而促进EEF1A1与核定位的MDM2分子的相互作用,增强MDM2对p53泛素化的调节作用,抑制p53下游分子功能,最终促进肿瘤进展。4)本研究为胃癌发生和进展提供了新的分子机制和治疗靶点。