第一部分 m6A甲基化修饰调控IRF8介导急性T淋巴细胞白血病发生发展的机制研究研究背景急性T淋巴细胞白血病（T cell acute lymphoblastic leukemia,T-ALL）是一组起源于造血干细胞的恶性克隆性疾病,其预后不佳,长期生存率仅25%-50%。深入挖掘T-ALL的发病机制,寻找新的治疗靶点,研发靶向策略,延长患者生存,不仅是T-ALL临床及基础研究的热点,更具有重大的科学意义和潜在的临床应用前景。干扰素调节因子8（interferon regulatory factor 8,IRF8）作为关键的转录调控因子,在髓系造血细胞的分化过程中具有决定性作用。近期研究发现,IRF8在淋巴细胞的分化和功能中也具有关键性作用。IRF8可通过整合T细胞受体（TCR）及细胞因子相关通路,促进幼稚的CD8 T细胞向效应细胞的转化。此外,它还是Th17细胞分化的负调节因子,通过转录抑制孤核受体RORC的表达,抑制Th17细胞的形成及功能。我们通过挖掘公共数据库信息发现,IRF8在T-ALL中的表达显著降低,提示其可能参与T-ALL的发生发展。然而,IRF8在T-ALL中的作用及机制仍需进一步阐明。m6A甲基化修饰是mRNA中含量最为丰富并对其动态调节影响最大的一种内部化学修饰方式。FTO是首个被证实的m6A去甲基化酶,负责“擦除”RNA的m6A修饰,从而使细胞的m6A修饰成为一个可逆的过程。FTO介导的m6A甲基化水平异常调控多种乳腺癌、肺癌、胃癌等多种恶性肿瘤的病理过程。在伴MLL重排的AML中,FTO高度活化,其通过抑制ASB2、RARA的m6A修饰水平调控基因表达,从而促进AML细胞的生长及耐药。我们分析了 GEO数据库中T-ALL患者的基因数据,结果发现FTO在T-ALL中表达显著升高。然而,FTO是否可通过调控IRF8的m6A修饰影响T-ALL发生发展仍有待进一步研究。实验目的1.结合临床标本,体内实验及体外实验结果,证实IRF8在T-ALL发生发展中重要的抑癌作用,阐明IRF8通过转录抑制PIK3R5负调控PI3K/AKT通路从而抑制T-ALL发生发展。2.探索FTO介导的m6A甲基化修饰调控IRF8表达的具体机制,并从体内外探讨FTO抑制剂靶向IRF8用于T-ALL治疗的可行性。实验方法1.GEO数据库筛选差异基因,临床患者标本验证IRF8表达。2.慢病毒上调T-ALL细胞系Molt4及Jurkat中IRF8的表达,CCK8实验检测细胞增殖,EdU实验检测DNA复制速率,细胞周期实验检测细胞周期分布,半固体培养实验检测细胞克隆形成能力,Transwell小室培养检测细胞的侵袭及迁移能力。3.利用Irf8基因敲除鼠,在骨髓造血干/祖细胞（Lin-细胞）中过表达NOTCH1,构建Irf8敲除型及Irf8野生型T-ALL骨髓移植小鼠模型。骨髓及外周血涂片,肝脾H＆E染色,外周血细胞计数及流式细胞术检测小鼠骨髓、外周血、肝脾中白血病细胞的浸润情况。观察两组小鼠的生存情况。4.RNA-seq筛选IRF8下游分子及通路,并用Western Blot（WB）及免疫组化实验验证。ChIP实验及双荧光素酶实验验证IRF8作为转录因子对下游分子的调控方式及具体位点。5.患者基因数据分析筛选T-ALL相关的关键分子FTO。临床标本验证FTO的表达。应用慢病毒在T-ALL细胞中下调FTO,或者FTO抑制剂抑制FTO去甲基化酶活性,dot-blot检测细胞m6A水平,并检测细胞增殖功能及IRF8表达改变。恢复实验验证FTO对细胞增殖能力的调控是否依赖与IRF8的表达水平改变。6.RNA-seq及m6A数据库联合分析FTO通过m6A甲基化修饰调控IRF8表达的作用及位点,并用MeRIP及双荧光素酶实验验证。RNA稳定性实验检测IRF8 mRNA上调机制。7.利用FTO抑制剂静脉注射Irf8敲除型及Irf8野生型T-ALL骨髓移植小鼠,探索FTO抑制剂上调IRF8表达从而治疗T-ALL的可行性。实验结果1.通过多个T-ALL相关数据集筛选共同差异基因IRF8。临床患者标本qPCR及WB结果证实IRF8在T-ALL中表达受抑。2.上调T-ALL细胞系Molt4及Jurkat中IRF8的表达显著抑制了细胞增殖、减缓DNA复制速率,导致细胞周期阻滞于G0/G1期,同时,细胞克隆形成能力、侵袭及迁移能力均受到抑制。3.Irf8敲除型T-ALL骨髓移植小鼠相对于Irf8野生型T-ALL骨髓移植小鼠,骨髓及外周血,肝脾中白血病浸润更明显,白血病负荷明显升高,白血病细胞增殖更快,小鼠生存时间明显缩短。4.RNA-seq筛选IRF8下游分子PIK3R5及通路PI3K/AKT。WB及免疫组化实验证实IRF8在体内外均可负调控PIK3R5及PI3K/AKT通路。ChIP实验及双荧光素酶实验验证IRF8作为转录因子,可与PIK3R5启动子区的结合位点直接结合,抑制PIK3R5转录,并确定了具体结合位点。5.GSEA分析患者基因数据,筛选出T-ALL发病相关的关键分子FTO,并用临床标本验证FTO的异常高表达。应用慢病毒在T-ALL细胞中下调FTO,IRF8表达显著升高,细胞增殖受抑。应用FTO抑制剂抑制FTO去甲基化酶活性,dot-blot显示m6A水平显著升高,IRF8表达水平明显提示,同时细胞增殖显著受抑。恢复实验显示,使用慢病毒下调经过FTO抑制剂处理的Molt4细胞中IRF8的表达,可以显著恢复细胞增殖能力,提示FTO通过调控IRF8的表达水平影响T-ALL细胞的增殖能力。6.RNA-seq显示FTO负调控IRF8 mRNA的表达。m6A数据库分析发现IRF8 mRNA的3’UTR端存在2个潜在的m6A修饰位点表达的作用及位点。MeRIP及双荧光素酶实验证实,FTO通过调控IRF8 mRNA的3’UTR端的2个m6A位点的m6A修饰水平,负调控IRF8 mRNA的表达。RNA稳定性实验证实,FTO抑制剂可延长Molt4及Jurkat细胞中IRF8 mRNA的半衰期。7.利用FTO抑制剂FB23-2静脉注射Irf8敲除型及Irf8野生型T-ALL骨髓移植小鼠,发现Irf8野生型T-ALL骨髓移植小鼠经过FTO抑制剂治疗后骨髓、外周血及脾脏白血病负荷显著减轻,白血病细胞增殖减慢,小鼠生存显著延长。而FB23-2对Irf8敲除型T-ALL小鼠的治疗效果不明显。Dot-blot实验显示,FTO抑制剂显著提升了Irf8野生型T-ALL小鼠体内白血病细胞的m6A水平,WB及免疫组化实验证实,FB23-2治疗显著升高了小鼠骨髓及脾中IRF8的表达,并抑制其下游PIK3R5/PI3K/AKT通路。研究结论1.IRF8在T-ALL中表达异常沉默,通过转录抑制PIK3R5及PI3K/AKT通路,抑制T-ALL细胞的增殖,将细胞周期阻滞于G0/G1期,减弱细胞克隆形成与侵袭迁移能力。在体内敲除Irf8基因可显著促进T-ALL的发病,缩短小鼠生存时间。2.FTO通过调控IRF8 mRNA上m6A位点的m6A修饰,促进IRF8 mRNA的降解,从而抑制IRF8的表达。体内使用FTO抑制剂可通过上调IRF8表达,抑制PIK3R5/PI3K/AKT通路,有效延缓T-ALL发生发展。第二部分 DT7多肽修饰共载γ-分泌酶抑制剂和地塞米松的脂质纳米粒治疗急性T淋巴细胞白血病的机制研究研究背景急性T淋巴细胞白血病（T cell acute lymphoblastic leukemia,T-ALL）预后差,长期生存率不足50%,其中约40%的成人T-ALL患者在病程中出现复发,复发的T-ALL患者往往预后不良,死亡风险明显升高,五年生存率低于7%,严重影响患者生存。糖皮质激素耐药是T-ALL复发的重要风险因素。因此,开发靶向策略增加T-ALL对糖皮质激素的敏感性,改善治疗效果,延长患者生存,仍然具有迫切的临床需求。研究发现,NOTCH1信号通路可能参与T-ALL地塞米松耐药的发生。γ-分泌酶抑制剂（GSI）是一种高效的选择性的NOTCH1信号通路的小分子抑制剂,能有效地抑制NOTCH1信号通路的活化,提升T-ALL细胞表面糖皮质激素受体（GR）的表达量,从而恢复细胞对糖皮质激素的反应敏感性。既往研究显示,GSI的全身应用容易导致较为严重的胃肠道不良反应,使GSI的临床应用面临极大的阻碍。然而,联用地塞米松（DEX）可以显著减轻肠道的杯状细胞化生,从而缓解GSI导致的胃肠道不良反应。因此,DEX与GSI两药联用,不仅具有协同抗白血病效果,更能减轻药物不良反应。但是传统的全身给药方法,药物在骨髓中的蓄积效率低,药物副作用大,亟待开发新型靶向递药方法。为解决药物递送至骨髓的难题,我们设计制备了D型T7（DT7）多肽修饰的纳米粒（TLnp）,用以增强GSI和DEX的骨髓靶向输送。TLnp的基础组成成分为卵磷脂,具有良好的细胞亲和性和组织相容性,更易于运输到骨髓。其次,TLnp的粒径控制在40 nm以下,能更有效地通过被动靶向作用输送至骨髓中。更重要的是,TLnp表面修饰了DT7多肽,能特异性靶向T-ALL细胞表面的转铁蛋白受体（TfR）,促进细胞对药物的主动摄入。该体系具有高度临床转化前景,并可为其他类型的血液系统恶性疾病的治疗提供新的思路。实验目的1.制备及表征DT7肽修饰共载DEX和GSI的脂质纳米粒（TLnp/D＆G）,阐明TLnp/D＆G可增强药物在骨髓T-ALL细胞内的积聚。2.体内及体外研究阐明TLnp/D＆G对T-ALL细胞系,原代T-ALL细胞,以及CEM荷瘤小鼠和NOTCH1诱导的T-ALL小鼠的抗白血病疗效,探索其分子机制,并研究TLnp/D＆G的安全性及胃肠道毒性。实验方法1.计算γ-分泌酶抑制剂和地塞米松的最佳药物比例,薄膜水化法制备DT7修饰共载DEX及GSI的脂质纳米颗粒,1H NMR谱表征DT7偶联,透射电镜观察药物形态,并检测纳米颗粒的粒径、电位、载药量及包封率,动态膜透析法绘制脂质纳米颗粒体外释放曲线。2.通过小鼠活体实时荧光成像的实验方法考察TLnp体内主动靶向肿瘤细胞的能力。流式细胞术检测T-ALL细胞系、T-ALL患者的原代T-ALL细胞和原代骨髓内皮细胞（BMEC）表面TfR的表达水平。利用HUVEC与CEM体外共培养模型,检测TLnp穿过内皮屏障递送至T-ALL细胞的的能力。体外细胞摄取实验评估TLnp共递送两种药物进入T-ALL细胞的效率。3.体外应用CCK8细胞毒性实验及凋亡实验考察TLnp/D＆G相对于其他非靶向,非联用制剂对T-ALL细胞系及原代细胞的杀伤能力。通过Western blot实验检测NOTCHI胞内段（NICD）,p-AKT,GR,BCL2的蛋白水平改变,探索TLnp/D＆G协同增强抗白血病效果的分子机制。4.对CEM荷瘤小鼠及NOTCH1诱导的T-ALL小鼠进行不同制剂静脉注射,检测小鼠的肿瘤负荷情况及生存情况,Ki67及Tunel免疫荧光染色考察TLnp/D＆G的体内抗白血病能力,NICD,p-AKT,GR,BCL2免疫荧光实验验证TLnp/D＆G协同增强药效的分子机制。5.通过小肠组织切片H＆E染色,PAS染色及KLF4免疫组化染色、观测小鼠体重等方法探索TLnp/D＆G对胃肠道毒性的减轻作用及分子机制,通过主要器官H＆E染色及溶血实验考察TLnp/D＆G的初步安全性。实验结果1.药物摩尔比DEX:GSI=1:1时,两药联用指数最低,为0.52±0.04,表明两药联用达到协同作用。核磁证实靶向配体DT7成功偶联至纳米载体表面。制备的TLnp/D＆G结构呈球形,粒径较小,平均直径为32.36±2.15 nm,具有明显的缓释效果,载药量高,分散性较好,可以满足后期体内体外实验的需求。2.CEM荷瘤小鼠中,TLnp组在肿瘤部位的荧光强度明显高于Lnp组,而游离药组最弱。24小时荧光观察显示,制剂具有良好的主动靶向肿瘤组织作用,长循环作用和缓释效果。NOTCH1诱导的全身发病T-ALL小鼠中,TLnp组胫骨处荧光值也明显高于Lnp组及游离药组,且骨髓细胞的荧光强度显著升高。3.流式结果显示,多个T-ALL细胞系表面均高表达TfR。原代T-ALL细胞表面TfR表达显著高于正常对照,同时原代骨髓内皮细胞表面TfR表达也显著高于正常对照。4.共培养体系下细胞体外摄取实验显示,TLnp组CEM细胞荧光亮度明显高于Lnp组,说明TLnp穿过内皮细胞并靶向CEM细胞的能力最强。体外细胞摄取实验显示,TLnp靶向纳米载体的共递送能力明显优于Lnp组及游离制剂组。5.体外CCK8细胞毒性实验及凋亡实验显示,TLnp/D＆G对T-ALL细胞系的生存抑制效果明显优于Lnp/D＆G及其他组,对凋亡的诱导能力最强。TLnp/D＆G对原代T-ALL细胞的凋亡诱导能力也最显著。WB实验显示,TLnp/D＆G协同抑制NOTCH1的活化及p-AKT的表达,同时升高糖皮质激素受体（GR）的表达,共同抑制BCL2的表达。6.体内药效实验显示,TLnp/D＆G对CEM荷瘤小鼠肿瘤生长的抑制能力最强,显著抑制Ki67表达,升高Tunel 阳性率。免疫荧光显示,肿瘤组织中活化的NOTCH1（NICD）及p-AKT的表达减弱,GR表达升高,BCL2的表达显著受抑。在NOTCH1诱导的T-ALL小鼠中,TLnp/D＆G显著抑制骨髓、外周血及脾脏中白血病负荷,延长小鼠生存,且免疫荧光进一步证实了上述分子机制。7.TLnp/D＆G处理组小鼠小肠粘膜上皮细胞中KLF4的表达及PAS阳性细胞显著低于单用GSI组,杯状细胞化生程度显著减轻。TLnp/D＆G处理组小鼠主要脏器结构正常,且体外溶血实验呈阴性反应。研究结论1.成功合成了 DT7肽修饰共载DEX和GSI的脂质纳米粒（TLnp/D＆G）,该纳米载体显著增强药物共递送至骨髓T-ALL细胞的效率。2.TLnp/D＆G具有优秀的体内及体外抗白血病效果,通过抑制NOTCH1的活化及p-AKT的表达,升高细胞表面GR的水平,协同抑制BCL2的生成,促进细胞凋亡,逆转地塞米松耐药。3.TLnp/D＆G显著减轻了 GSI导致的胃肠道不良反应,说明该靶向共载药脂质纳米颗粒具有良好的安全性。