目的《中国心血管健康与疾病报告2020》指出,我国心血管病的发病率和死亡率均呈现出逐年上升的趋势,心血管病已然成为导致城乡居民死亡的主要原因之一。同时,心血管病患者也逐渐趋向于年轻化,因此,心血管病受到了越来越多的重视。在众多的心血管病类型中,心肌梗死和缺血性损伤具有较高的致死率,并且再灌注治疗所导致的心肌缺血/再灌注（ischemic/reperfusion,I/R）损伤会诱导心肌细胞发生包括凋亡、焦亡、铁死亡在内的多种程序性细胞死亡。其中,心肌细胞焦亡在心肌细胞I/R损伤过程中发挥着重要作用。PIWI-interacting RNA（piRNA）是近几年才被发现的一种长度约为30 nt的非编码RNA,因其与PIWI蛋白家族成员相结合后才能发挥生物学功能,故被称为piRNA。piRNA已被证明在生殖疾病中具有重要的作用,但其在心脏相关疾病中的调控机制仍然有待探索。随着对piRNA的研究不断深入,研究者们发现piRNA的作用不再局限于生殖细胞,越来越多的证据表明,它们在心脏、肝脏、肾脏、神经系统和胰岛等组织器官的体细胞中也会表达,这说明piRNA在这些组织器官的生理病理过程中也可能发挥着重要的作用。本研究通过在体外构建缺氧/复氧（hypoxia/reoxygenation,H/R）模型来诱导小鼠乳鼠原代心肌细胞（Primary neonatal mouse cardiomyocytes,NMCs）焦亡,发现piR-16744在发生焦亡的NMCs中明显下调。因此,通过探索piR-16744对H/R诱导的NMCs焦亡的作用及其潜在的作用机制,为缓解和逆转心肌I/R损伤提供理论依据。方法本实验以小鼠乳鼠的原代心肌细胞为研究对象,在体外构建由H/R诱导NMCs焦亡的模型,设置缺氧6 h、12 h、24 h复氧6 h的时间梯度,筛选出诱导NMCs发生焦亡的最佳时间点;使用高通量基因测序技术以及实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR,q RT-PCR）技术对发生焦亡的NMCs中的piRNA进行筛选;利用q RT-PCR技术验证piR-16744在I/R损伤的心脏组织和焦亡的NMCs中的表达;在正常的NMCs中使用antagomir敲低piR-16744;在H/R处理的NMCs中使用agomir过表达piR-16744;利用Western blot技术检测焦亡相关蛋白消皮素D（Gasdermin D,GSDMD）、GSDMD-C、Caspase-1和炎症相关因子白细胞介素-1β（Interleukin-1β,IL-1β）以及IL-18的表达水平;同时利用LDH法和PI染色法检测细胞存活水平;在NMCs中,首先使用si RNA敲低Caspase-1,然后利用antagomir敲低piR-16744,验证piR-16744参与调控的信号通路;此外,使用活性氧（reactive oxygen species,ROS）检测试剂盒对NMCs中的ROS水平进行检测;同时,利用pull down实验和生物信息学的方法分析piR-16744潜在的调控通路。结果1、NMCs经缺氧6 h复氧6 h处理后焦亡最为明显;2、piR-16744在I/R损伤的心脏组织和焦亡的NMCs中明显下调;3、在NMCs中,敲低piR-16744可以促进焦亡相关蛋白的表达,使细胞死亡率升高,ROS表达增多;4、在H/R处理的NMCs中,过表达piR-16744可以抑制焦亡相关蛋白的表达,降低细胞死亡率,ROS表达减弱;5、在NMCs中,敲低Caspase-1可以减弱因敲低piR-16744导致的焦亡相关蛋白的表达;6、piR-16744可能通过丙酮酸途径、胰高血糖素信号途径或者二型糖尿病途径参与调控心肌I/R损伤。结论本研究成功在体外构建了由H/R诱导的NMCs焦亡的模型。并发现piR-16744在I/R损伤的心脏组织和焦亡的NMCs中明显下调,在正常的NMCs中,敲低piR-16744促使NMCs发生焦亡。在H/R处理的NMCs中,过表达piR-16744可以抑制NMCs焦亡的发生。并且piR-16744是通过依赖于Caspase-1的焦亡经典信号通路参与调控H/R诱导的NMCs的焦亡。此外,预测piR-16744可能是通过丙酮酸途径、胰高血糖素信号途径或者二型糖尿病途径参与调控心肌I/R损伤。综上,本研究通过探讨piR-16744在NMCs焦亡过程中的作用及潜在的作用机制,为缓解和逆转心肌损伤提供理论依据。