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PHSP1,豌豆(Pisum sativum)线粒体热激蛋白70(mitoehondrial heatshock protein,mtHSP70)基因,其编码产物为HSP70家族成员,在线粒体前体蛋白跨膜转运中起着重要作用。
本研究首先利用基因工程方法构建了原核表载体pET-28a-PHSP1和pET-His-PHSP1将重组质粒pET-28a-PHSP1转化大肠杆菌BL21(DE3),经0.5mmol/L IPTG(异丙基B-D-硫代半乳糖苷)37℃诱导4h,12%SDS-PAGE电泳,可见一分子量约为70 kDa的蛋白条带,用抗mtHSP70特异性抗体进行Western blotting杂交检测,证实该表达蛋白确是PHSP1蛋白。进一步优化了外源PHSP1基因在大肠杆菌中的表达条件(IPTG浓度、温度、时间),表明0.25mmol/L IPTG、37℃、诱导5h,目的蛋白表达量最高。该外源基因在大肠杆菌BL21(DE3)qb表达量高于ER2566,pET-28a-PHSP1在BL21(DE3)中表达量高于pET-His-PHSP1。
其次,构建了植物表达载体pB1121-PHSP1,将PHSP1置于CaMV35S启动子控制之下,通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105介导,将PHSP1基因转入烟草叶片组织中。30d后,经卡那霉素筛选获得抗性苗。对获得的抗性苗进行PCR扩增和Western blotting检测,证实目的基因成功整合到烟草基因组并得以表达。
对野生型和转基因烟草进行盐胁迫处理(0、100、300mmol/L NaCl,时间为0、6、24、48h),发现300mmol/L NaCl胁迫48h后,野生型烟草叶片损伤程度较转基因烟草严重。进一步测定叶片SOD(超氧化物歧化酶)、POD(过氧化物酶)活性、CAT(过氧化氢酶)。结果表明,随着盐浓度提高及胁迫时间延长,三种酶活性变化不同,但同一处理下,转基因烟草酶活性始终高于野生型。表明转PHSPI基因在盐胁迫条件下减缓了保护酶活性的降低,有利于提高烟草抗氧化能力及耐盐性。