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【研究目的】高血压是人类常发和多发疾病,其并发症脑卒中、心力衰竭等多种心血管疾病严重影响人类健康,也一直是心血管领域研究的重点内容。大量的研究显示肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system, RAS)的异常与高血压病的产生、发展和预后关系十分密切,RAS通路上一些靶点的干预处理是治疗高血压病的主要策略之一。中枢血管紧张素Ⅱ(AngiotensinⅡ, AngⅡ)增强与中枢血管紧张素1-7(Angiotensin 1-7, Ang 1-7)降低是高血压病心血管功能紊乱的一个重要原因,纠正中枢AngⅡ与Ang 1-7的平衡关系在治疗高血压病中具有重要的意义。运动训练(Exercise training, ExT)不仅可以通过降低肥胖等途径减少心血管疾病的危险因素,更为重要的是ExT本身就具有改善高血压状态下心血管功能异常的作用,如降低血压等,因而ExT在高血压防治中的作用已引起众多学者的关注,但ExT改善高血压的作用机制并不清楚。有研究显示中枢神经系统内神经元结构和功能的重塑可能是ExT改善高血压的主要机制,因此本研究主要明确中枢血管紧张素机制在介导ExT改善高血压中的作用,并进一步研究Ang1-7中枢心血管效应的作用机制。因此,我们首先研究了ExT对自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rat, SHR)中枢血管紧张素系统的作用,通过脑室内(intracerebroventricular, ICV)注射AngⅡ和Ang 1-7相应受体的激动剂和拮抗剂来明确ExT对中枢血管紧张素系统的功能改变,并通过Western Blot和免疫荧光组化的方法初步探索ExT对中枢血管紧张素机制的作用部位。另一方面,我们研究了中枢孤束核Ang 1-7的心血管效应与一氧化氮(Nitric Oxide, NO)机制的相互关系,并明确了中枢Ang 1-7对心血管NTS内NOS表达的作用。【方法】第一部分的实验动物为雄性SHR、Wistar-Kyoto (WKY)大鼠。在对照和12周训练动物组中,ICV分别给予AngⅡ(200 pmol)和AngⅡ受体阻断剂Sarthran (15 nmol), Ang 1-7 (400 pmol)及其Ang1-7的受体阻断剂A779 (500 pmol),分别观察其对心血管活动的影响；通过免疫组织化学和Western Blot技术定量检测ExT后NTS中AT1受体、ACE、Mas受体和ACE2的蛋白表达。第二部分实验在Sprague-Dawley (SD)大鼠模型上,神经型一氧化氮合酶(nNOS)抑制剂7-硝基吲唑(7-nitroindazole,7-NI,10,100 pmol)预处理前后观察NTS内微量注射Ang 1-7(25 pmol)导致的心血管效应的变化,并观察了注射NO前体L-精氨酸(L-arginine, L-Arg,2 nmol)在25 pmol Ang 1-7预处理前后的心血管功能效应的变化。通过Western Blot检测ICV慢性给予Ang 1-7 (100 pmol/d,3 days)后NTS中NOS的蛋白表达变化。【结果】1.ExT改善高血压状态下的中枢血管紧张素系统介导的心血管功能第一部分实验分为整体急性动物实验和分子生物学实验两部分。整体急性动物实验分为3组,即WKY休息组(WKY-Sedentary, WKY-S), SHR休息组(SHR-Sedentary, SHR-S)和SHR训练组(SHR-Training, SHR-T);分子生物学实验分为4组,即WKY-S组,WKY训练组(WKY-Training, WKY-T), SHR-S组和SHR-T组。1.1 ExT对SHR和WKY大鼠基础心血管活动的影响训练组动物接受12周连续低强度跑步训练。每间隔4周尾动脉监测血压(blood pressure, BP)和心率(heart rate, HR)。ExT后,SHR-T组的BP上升的趋势较之SHR-S显著减缓(P<0.05),但HR的变化没有明显差别。WKY大鼠的BP和HR在ExT前后没有显著差异变化。清醒自由活动状态下压力反射测定显示,SHR-T组的压力反射功能显著高于SHR-S组(P<0.05)。1.2 ExT对中枢血管紧张素效应的影响1.2.1 AngⅡ(200 pmol) ICV急性灌注可引起显著的平均动脉压(mean arterial pressure, MAP)升高(WKY-S:10±3 mmHg; SHR-S:32±4 mmHg; SHR-T:18±3 mmHg)。SHR-T组与SHR-S组相比,其MAP在BP升高的幅度和持续时间方面具有显著减弱(P<0.05),HR无显著差异。1.2.2 Sarthran (15 nmol) ICV急性灌注可引起显著的MAP降低(WKY-S:-19±2 mmHg; SHR-S:-40±3 mmHg; SHR-T:-28±3 mmHg)。ExT后,SHR对Sarthran的敏感性显著减弱,其MAP在下降的幅度和持续时间具有显著弱于SHR-S (P<0.05), HR无显著差异。1.2.3 Ang 1-7 (400 pmol) ICV急性灌注,WKY-S组MAP轻度升高(5±1mmHg)后缓慢回落至基础值；而SHR-S组Ang 1-7灌注10 min出现BP的缓慢并且持续的下降,在30 min左右血压可下降10±3 mmHg; SHR-T组10 minMAP升高达到最高(10±3 mmHg)后逐渐回落。以上各组灌注Ang 1-7后HR没有明显变化。1.2.4 A779(500 pmol)ICV急性灌注可引起SHR-S和WKY-S组的MAP降低(SHR-S:-15±4 mmHg;WKY-S:-11±4 mmHg),而SHR-T MAP却升高(22±4 mmHg),且具有显著差异(P<0.05),而HR无显著差异。1.3 ExT对NTS内中枢血管紧张素系统主要信号成分的蛋白表达的影响Western Blot和免疫组织化学显示,SHR NTS中AngⅡ生成所需的血管紧张素转换酶(angiotensin converting enzyme,ACE)和AngⅡ作用主要受体AT1R蛋白表达较WKY显著增强(P<0.05),而Ang 1-7生成所需的血管紧张素转换酶2(angiotensin converting enzyme 2,ACE2)和作用受体Mas受体蛋白均无显著差异(P>0.05)。ExT后,WKY和SHR的NTS处的ACE、AT1R、ACE2和MasR蛋白表达较相应对照均无显著差异(P>0.05)。2.NO在介导中枢Ang 1-7心血管效应中的作用2.1 Ang 1-7慢性ICV灌注2.1.1 Ang 1-7慢性ICV灌注对心血管活动的影响与aCSF组相比,ICV灌注Ang 1-7(100 pmol/d,3 days)组MAP(aCSF:122±4 vs.121±3 mmHg;Ang 1-7:125±1 vs.119±1 mmHg)显著下降(P<0.05),而HR没有明显变化。2.1.2分子生物学实验结果NO含量测定显示侧脑室灌流后Ang 1-7后NTS中的NO含量显著增加(P<0.05)。Western Blot显示,与灌注aCSF组相比,Ang 1-7组的NTS中nNOS蛋白表达显著上调(P<0.05),而eNOS和iNOS蛋白表达无明显变化(P>0.05)。2.2 7-NI对NTS内Ang 1-7效应的影响单侧NTS预处理aCSF后微量注射Ang1-7(25 pmol),引起MAP降低12±1mmHg(103±1 vs.91±1 mmHg,n=4,P<0.05)和HR减慢(-14±5 bpm, P<0.05)。nNOS抑制剂7-NI(100 pmol)能显著抑制Ang 1-7引起的MAP下降(-12±1 vs.-4±1 mmHg,P<0.05)和HR减慢(-14±5 bpm vs.-8±2 bpm, P<0.05)。2.3 Ang 1-7对NTS内L-Arg效应的影响NTS预处理Ang 1-7(25 pmol)可以显著抑制L-Arg(2 nmol)引起的MAP下降(-29±5 vs.-19±3 mmHg)、HR减慢(-16±3 vs.-11±2 bpm)和肾交感神经放电抑制(-44±5 vs.-26±4％)。Ang 1-7慢性持续灌流3天后可以显著增强NTS微量注射L-Arg引起的MAP下降(-33±3 vs.-25±2 mmHg)、HR减慢(-21±3 vs.-14±2 bpm)和肾交感神经放电抑制(-63±4 vs.-43±4%)。【结论】本研究明确了ExT通过下调中枢AngⅡ和上调Ang 1-7作用机制来改善高血压状态下的心血管功能异常,并发现NTS内nNOS诱导的NO机制在介导Ang1-7诱导的中枢心血管效应中具有重要作用。