CD40(cluster of differention 40)是肿瘤坏死因子受体超家族成员之一,属于I型跨膜糖蛋白,主要表达在上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞、造血细胞、一些肿瘤细胞以及免疫细胞表面。免疫细胞表面的CD40与活化的T细胞产生的CD40L结合,可促进树突状细胞(Dendritic cells,DCs)增殖、分化和成熟,增强其抗原提呈能力和吞噬凋亡细胞的能力;也可作为B细胞活化的第二信号,参与了B细胞的活化、增殖和分化过程,促进抗体的产生和类型转换,并能使即将凋亡的B细胞存活并增殖,形成生发中心;还可明显上调APC细胞表达CD80和CD86分子,来作为T细胞活化的第二信号,能有效刺激机体免疫系统。一直以来,缺乏有效的早期受孕检测手段是制约奶牛行业发展的一大问题,可导致奶牛空怀期长、繁殖率低以及成本提高等问题。奶牛早孕因子(EPF)是最早被确认为妊娠期的生化标志之一,故EPF的有无可作为早期是否受孕的可靠指标。本课题前期根据EPF表位序列设计合成了由14个氨基酸组成的B细胞表位肽,该B细胞表位肽属于小分子半抗原。由于小分子免疫原性弱,免疫过程需偶联到大的载体蛋白上,且常用的弗氏佐剂具有毒性,不易被吸收等缺点,因此小分子物质抗体制备较为困难,亟需开发一种针对小分子的无需偶联、无需乳化、使用便捷的免疫佐剂。许多研究表明CD40抗体可模拟CD40L与B细胞表面的CD40结合,发挥类似CD40-CD40L结合的生物学功能,促进B细胞活化产生抗体。基于以上背景,本实验以设计合成的EPF B细胞表位肽作为免疫原,初步探究CD40抗体对小分子肽的免疫增强效果,为开发一种新型针对半抗原免疫的佐剂奠定基础。首先用DNA Star对BALB/c小鼠CD40胞外段进行生物信息学分析,预测其抗原性;然后将胞外段进行原核表达并纯化;制备并纯化CD40抗体,分析其适用性;最后将CD40抗体与该B细胞表位肽共同免疫BALB/c小鼠,通过测得各组小鼠不同时期血清抗体水平的变化以及脾脏B细胞CD分子、相关细胞因子在mRNA水平或蛋白水平的差异表达,来分析CD40抗体对该B细胞表位肽的免疫效果的影响。结果表明,用DNA Star分析CD40胞外段二级结构,并预测抗原表位为5~29、32~49、50~101、114~130、136~163、168~173位氨基酸残基处,抗原性较强,可作为制备抗体的良好免疫原;成功表达并纯化出CD40胞外段重组蛋白。免疫家兔,成功制备并纯化出CD40多克隆抗体,且能与小鼠CD40天然蛋白特异性结合,适用性较好。免疫增强实验显示,10μg和20μg CD40抗体对该B细胞表位肽抗体水平提升较明显,2μg CD40抗体免疫增强效果不明显;荧光定量PCR结果表明,在mRNA水平上,各阶段10μg和20μg CD40抗体组中CD19、CD86、CD138、IL-4和IL-5表达上调极显著;IL-2和IFN-γ在各组中有提升但不明显,说明10μg和20μg CD40抗体可引起显著的B细胞增殖并分化出大量浆细胞,且以体液免疫反应为主。ELISA检测结果表明,在血清水平上,各阶段在10μg和20μg CD40抗体组中IL-4和IL-5表达上调明显,IFN-γ也显示少量表达上调;IL-2在各CD40抗体组中有提升但不明显,结果说明10μg和20μg CD40抗体可引起显著的Th2型免疫反应,也可引起轻微的Th1型免疫反应,但以Th2型免疫反应为主。综上所述,本实验制备的CD40抗体以10μg或20μg/只/次的剂量,对该设计合成的B细胞表位肽可引起明显的血清抗体提升效果,且机体发生的免疫反应以Th2型体液免疫反应为主,为进一步探讨CD40抗体对辅助小分子物质的免疫机制及新型佐剂的开发提供实验基础。