研究背景与实验目的:在全球肝癌的发病率位居肿瘤的第五位,也是全球导致死亡的主要癌症之一。肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）是最常见的原发性肝癌,占所有肝癌的75%-85%。尤其在中国,慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B,CHB）发病率居高不下,由于慢性乙型肝炎-肝硬化-肝癌“三部曲”的疾病进展过程的存在,HBV感染后HCC占我国肝癌发病率的80%。HCC临床特点是发病率高,病死率高,缺乏典型的临床症状,大部分患者明确诊断时已经处于疾病中晚期。随着我们对HCC分子生物学理解的不断深入,新的诊疗方法不断呈现,HCC的早期诊断和治疗方法已取得显著进展,但是,仍然缺乏HCC早期诊疗的特异性靶点并且关于HBV如何参与HCC发生发展的详细分子机制也不甚明了。因此,阐明HCC的发病机制与寻找HCC的特异性治疗靶点对于提高HCC的诊疗水平有重要的意义。人们普遍认为HCC的发生发展过程是一个多因素、多步骤的复杂过程,同时受到环境和遗传因素的影响。非编码RNA（non-coding RNA）是一类不能翻译成蛋白的RNA,包括长链非编码RNA（long non-coding RNA,lnc RNA）,微小RNA（micro RNA,mi RNA）,环状RNA（circle RNA,cir RNA）等,越来越多的证据表明,这些非编码RNA是基因表达的重要调控因子,参与肿瘤的发生发展等多种生理病理过程。研究发现非编码RNA的转录可以通过启动子干扰或改变染色质结构来影响邻近基因的表达,间接性的调控基因翻译。非编码RNA也参与表观基因调控过程,通过调节染色质的可及性同时激活或抑制多个基因位点。所以非编码RNA与基因在疾病发生病理生理过程中发挥不同的功能。已有的研究明确指出非编码RNA在HCC发生发展发挥重要的作用。某些非编码RNA可以调节肝脏免疫细胞的活化与细胞增殖的信号通路,加重肝炎与肝纤维化,最终导致HCC发生。非编码RNA的紊乱表达,不仅可以与抑癌或者促癌基因相互作用,改变肿瘤细胞的干性与代谢状态;而且能启动肿瘤细胞增殖的信号通路增强HCC细胞的侵袭与转移能力。所以非编码RNA是HCC发展过程中的重要调控分子。研究非编码RNA在HCC发生发展的生物学功能,阐明非编码RNA在HCC的分子机制,将有助于非编码RNA作为HCC临床诊疗靶点的研发。但是,非编码RNA对HCC的调控作用及机制仍未完全清楚,且非编码RNA作为HCC分子治疗靶点的特异性研究仍不充分。本研究通过高通量测序技术与生物信息学方法系统性分析HCC的非编码RNA与基因的特点,探讨精准治疗的靶点,进一步通过细胞和动物实验进行分子机制的研究。一方面明确mi RNA与代谢通路的基因相互作用促进HCC发生的机制,另一方面阐明紊乱表达的lnc RNA在HCC预后评估的意义。另外基于HCC的基因表达谱,我们描绘了HCC的免疫微环境免疫细胞特点与构建HCC免疫评分的预后模型。研究方法通过检测HBV阳性（HBV+）和HBV阴性（HBV-）的HCC患者肿瘤组织的基因和非编码RNA的表达。系统性分析基因和mi RNA参与的生物学特点,通过多维度的生物信息学分析方法挖掘乙肝肝癌特异性的基因与mi RNA靶点,构建这些基因与mi RNA的调控网络。通过体外和体内实验验证了靶点在乙肝肝癌中的生物学功能。此外,我们还通过对非乙肝肝癌细胞系转染HBV,研究了HBV感染对肝癌细胞的增殖、侵袭与代谢的影响。然后进行生物信息学分析,以验证这些靶点在临床大样本中的诊疗价值。基于公共数据库的735例HCC患者基因表达谱,我们采用多系统的生物信息学方法研究肿瘤免疫微环境（Tumor immune microenvironment,TIME）的免疫细胞学特点。此外,还探讨了TIME分子亚型、基因分组和临床病理指标之间的关系,以构建HCC患者的预后评估模型。同时基于369例HCC患者的RNA-sequence数据,通过一系列系统的生物信息学方法研究lnc RNA的拷贝数（Copy number alteration,CNA）改变与自身表达的关系,验证lnc RNA作为HCC患者预后靶点的临床价值。研究结果:第一部分:我们对乙肝肝癌与非乙肝肝癌组织的测序数据进行分析,获得了35个上调表达（up-regulated）基因与75个下调表达（down-regulated）基因。对差异基因进行功能分析,发现糖酵解/糖异生（glycolysis/gluconeogenesis）通路在乙肝肝癌中发挥了重要功能,参与此通路的一个分支（糖酵解旁路）的一个重要基因为MINPP1,在乙肝肝癌发展过程中具有重要的生物学功能。MINPP1在乙肝肝癌中表达下调,可抑制肿瘤细胞的增殖和迁移。同时,基于测序数据分析获得24个上调表达的mi RNA。通过基因与mi RNA的关联分析、碱基配对、细胞实验与生物信息学分析发现mi RNA-30b-5p是调节MINPP1的重要的靶点。细胞实验验证mi RNA-30b-5p通过糖酵解旁路促进肿瘤细胞增殖。更重要的是,mi RNA-30b-5p可显著下调MINPP1的表达。代谢实验表明mi RNA-30b-5p/MINPP1轴能够加速葡萄糖向乳酸和2,3-双磷酸甘油酸（2,3-bisphosphoglycerate,2,3-BPG）的转化,产生更多的能量。在非乙肝肝癌细胞系中,mi RNA-30b-5p/MINPP1不能通过调节糖酵解旁路促进肿瘤的生长。当HBV转染进入非乙肝肝癌细胞后,mi RNA-30b-5p/MINPP1轴可显著促进糖酵解旁路能量代谢,增强肿瘤细胞的增殖、迁移能力。机制研究发现HBV的感染会通过HBV蛋白P（HBp）与转录因子—FOXO3相互作用促进mi RNA-30b-5p的表达,上调mi RNA-30b-5p的表达可以抑制MINPP1的表达,从而启动糖酵解旁路产生更多的能量供给乙肝肝癌细胞系的增殖。大数据HCC样本的生物信息学分析显示,MINPP1的上调表达与乙肝肝癌患者的生存预后具有良好的相关性,上调表达的MINPP1可能延缓乙肝肝癌的疾病进展。第二部分:基于公共数据库735例HCC患者的基因表达谱,我们将TIME和基因分别分为3个表型（TIME 1-3,T1-3）和2个基因簇（Gene 1-2,G1-2）。进一步分析发现G1基因簇与免疫激活和监控相关,包括CD8+T、自然杀伤细胞激活、和CD4+记忆T细胞激活。相反,G2基因簇表现为M0巨噬细胞和调节性T细胞的增加。我们用TIME不同表型之间差异性表达的78个基因构建TIME评分（TIME score,TS）模型。进一步研究发现G2与G1基因簇分别以高TS得分与低TS得分为特征,且分别与HCC预后不良和预后良好相关。相关分析显示,TS与多个HCC临床病理特征（如分级、分期、肿瘤（T）、淋巴结（N））和已知的体细胞基因突变（如TP53、CTNNB1）呈正相关。最后,我们应用外部数据集验证TS模型的对HCC患者预后的评估价值。第三部分:基于公共数据库369例HCC患者的CNA、基因表达综合聚类分析,将HCC患者分为5个分子亚群。不同表达分析显示,每个分子亚群上调表达的lnc RNA数量多于下调表达的lnc RNA。系统性生物信息学分析发现,不同表达的lnc RNA可细分为32个模块,其中最重要的2个模块与肿瘤发病机制有关。Lnc RNA的CNA分析显示,许多Lnc RNA位于频繁拷贝扩增或缺失的区域,其中8号染色体上发生CNA的频率最高。此外,CNA与lnc RNA表达呈正相关。我们发现3个lnc RNA（BAZ2B、SNHG20、MAFG-AS）的拷贝扩增与自身的上调表达相关,TMEM220-AS1拷贝缺失与自身的下调表达相关,上调表达的BAZ2B、SNHG20、MAFG-AS与下调表达的TMEM220-AS1与HCC患者预后不良呈明显正相关。结论:我们的研究发现了乙肝肝癌新的发病机制,即HBp/FOXO3/mi RNA-30b-5p/MINPP1轴通过糖酵解旁路作用促进肿瘤细胞的增殖和生长。并且本研究验证了mi RNA-30b-5p/MINPP1作为乙肝肝癌潜在的临床诊疗靶点。同时通过基因表达谱的系统性分析,揭示了基因调控HCC的TIME免疫细胞的组成与HCC的发生发展密切相关。我们还构建TS模型,并证明TS评分是一个有效的HCC患者预后模型。因为lnc RNA拷贝数改变引起表达水平的改变不仅是HCC发生的主要机制,同时也是HCC诊疗重要的分子靶点。