目的：肠上皮细胞是构筑肠道粘膜屏障的主要部分，还具有分泌、吸收等多种功能，在维持机体生命活动中居重要的地位。在核爆炸、核事故等多种情况下可发生病死率极高的肠型放射病，目前尚无有效的救治方法。肠上皮细胞是辐射敏感细胞，受一定剂量照射后，可发生增殖抑制、结构异常、坏死脱落，而且具有克隆形成能力的隐窝干细胞不能存活和重建小肠的隐窝、绒毛系统，导致肠道屏障的破坏以及修复困难，成为肠型放射病的根本原因。由于在体分离纯化隐窝干细胞存在技术困难，目前学者大都使用具有隐窝未分化细胞特点的细胞株IEC-6作为体外研究模型。本研究利用IEC-6细胞进行大剂量辐射诱导的差异表达基因的筛选，旨在为肠上皮细胞的辐射损伤修复的分子机制研究提供新的靶点，为放射性胃肠综合症提供新的治疗线索，同时将对细胞的增殖、分化、凋亡和转化等基本的生命问题提供启示和答案。方法：本研究以35Gyγ射线照射后24h的IEC-6细胞株为模型，分为两个部分进行。第一部分：大剂量辐射诱导IEC-6细胞差异表达基因消减cDNA文库的构建。包括以下内容：1）常规IEC-6细胞培养，传代致一定数量，待细胞处于对数生长期时，随机选取一半设为照射组，以60Co为辐射源, 进行35Gy一次性照射,另一半为正常对照组，两组在照射时相点后继续培养24h。2）对两组细胞进行总RNA分离，并做定量定性分析。3）照射组IEC-6来源总RNA为实验方（tester），对照组IEC-6来源总RNA为驱动方（driver），LDPCR方法合成双链cDNA。4）Rsa1酶切实验方和驱动方cDNA,产生较短的平头末端cDNA片段。5）通过连接反应，产生两种带有不同接头的Tester，而Driver不加接头。6）第一次杂交:过量的Driver cDNA和两种Tester cDNA变性、退火、杂交，使单链Tester cDNA片段实现均等化，保留了稀有转录子。第二次杂交:两种消减后的Tester cDNA同时和附加的Diver cDNA 杂交，使在第一次杂交中尚未完成杂交的单链Tester cDNA很容易找到互补序列进行退火。最终形成5ˊ末端带有不同接头的杂交体，两种接头提供了抑制性PCR的引物序列，使差异<WP=8>表达的cDNA通过两轮PCR进行特异性扩增。7）通过比较消减前后cDNA库中已知基因的丰度改变来评价消减效率。8）把正常组作为tester,照射组为driver，按上述步骤进行逆向消减杂交。9）对正向消减PCR产物进行T/A克隆，转化细菌，挑取克隆进行PCR扩增，检测插入片段大小。第二部分：1)反向Northern杂交： 用PCR法扩增插入cDNA片段，碱变性后，点样于尼龙膜上,制作相同拷贝的两张膜，标记正向消减和逆向消减的第二次PCR产物作为探针，分别与膜进行杂交，放射自显影法显示差异片段。2）将放射组和正常组的IEC-6细胞和大鼠肠上皮洗脱细胞的总RNA以及含有克隆U20的T载体质粒电泳后转印、交联在尼龙膜上，以克隆U20cDNA片段为模板标记的探针杂交，观察U20的表达情况。结果：1. 样本总RNA纯度高，完整性好，通过LD PCR 的方法获得足量的双链cDNA，Tester cDNA 片段酶切完全，至少有50％以上的片段连上相应接头。2. 以未消减的cDNA库为模板，扩增18个循环左右看见G3PDH的阳性条带，而以消减后的cDNA库为模板，扩增28个循环左右才见阳性条带，这提示差异表达的基因获得有效富集。3. 消减文库扩增后，可见2000左右的白色阳性克隆。挑选48个菌落用PCR进行分析可得97％以上的克隆含有插入片段，片段大小为250－1500bp,和与酶切和第二次PCR产物的结果相符。4. 反向Northern杂交对扩增的初筛结果:一共在96个克隆中找到12个信号有显著差别的cDNA克隆，经测序和检索，它们代表8个不同的基因，其中6个对应已克隆基因，两个是未克隆的EST序列。对其中一条已克隆但功能未知基因用Northern杂交进行鉴定分析，结果显示基因在放射组IEC－6细胞所表达水平升高，在正常对照IEC-6细胞表达弱；正常和放射组的在体洗脱细胞来源的RNA泳道上未见明显阳性条带；根据28S rRNA确定的实际分子量大小和检索结果相差7kb以上。结论： 1．联合应用抑制性消减杂交和T/A克隆、反向Northern杂交、正向Northern杂交，建立了差异表达基因克隆、筛选的技术平台。2．对大鼠空肠上皮细胞IEC－6进行了一个剂量（35Gy）,一个时相点（24h）的差异表达基因分析，建立了消减cDNA文库。3．筛选到12个差异表达基因的EST片断，它们代表8个不同的基因，其中6个对应已克隆基因，两个是未克隆的EST序列。主要和细胞骨架，细胞应激、细胞<WP=9>周期、信号转导等方面有关。一条EST序列和已知mRNA序列（小鼠胚胎来源，功能未知）高度同源，但Northern Blot分析确定其实际对应mRNA的分子量和检索的靶基因不同，且可能是隐窝细胞特异表达，表明它仍代表了大鼠肠上皮未克隆基因，这为此基因的全长克隆和进一步功能研究奠定了基础。总之，大剂量辐射诱导IEC-6 细胞差异表达基因的克隆和筛选为肠上皮辐射损伤修复的分子机制研究提供了新的靶点，拓宽了我们在这一领域的认知范围，为多角度深入研究肠上皮的辐射损伤修复奠定了基础。