香蕉枯萎病拮抗内生芽孢杆菌BEB17的分离鉴定及生防潜力分析

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本研究对采自海南、广西香蕉枯萎病区中健康香蕉植株的根部组织进行内生细菌的分离与纯化,共获得56株内生细菌,其中21株内生细菌具有抗菌活性。采用平板对峙法和双皿对峙法从中筛选获得一株内生细菌对香蕉枯萎病菌(Fusarium oxysporf.sp.cubense race 4,Foc4)、辣椒炭疽病菌(Colletotrichum capsici)、番茄多主棒孢病菌(Corynespora cassiicola)、稻瘟梨孢菌(Pyricularia oryzae)等多种植物病原真菌具有平板拮抗和熏蒸抑制作用,其平板拮抗抑菌率为32.24-54.69%,熏蒸抑菌率为33.92-66.86%,其中该菌株对香蕉枯萎病菌Foc4的抑菌活性最强,分别达54.69%和66.86%。通过菌落形态观察与生理生化特征分析,并结合16S rDNA(Genbank:MF444158)和gyr 基因序列(Genbank:MF471351)分析,鉴定该菌株为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens),编号为BEB17。通过PCR检测发现,内生解淀粉芽孢杆菌BEB17基因组中含有编码多种脂肽类和聚酮类化合物的相关合成基因,具有合成多种脂肽类和聚酮类化合物的潜力。采用两种提取方法(酸沉淀法和大孔树脂抽提法)和两种发酵培养基(M9和Landy培养基)对该菌株发酵液进行提取,结果发现酸沉淀法提取较为高效,Landy培养基更易于BEB17脂肽类和聚酮类物质的发酵。活性检测表明,两种提取方法提取的粗提物对香蕉枯萎病菌都具有较好的抑制作用,其中大孔树脂抽提法提取的物质抑制效果最好,当其浓度为300 μg/mL时抑制率可达80.75%。进一步研究表明,该提取物能引起Foc4菌丝膨大和畸形,对其细胞膜具有破坏作用,并可抑制其孢子萌发。通过基质协助激光解吸附离子化-飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)和液相色谱-质谱联用(LC-MS)分析,发现菌株 BEB17 能产生 Bacillibactin、Difficidin 和 Bacillaene 三类聚酮类化合物,表面活性素、泛革素A、泛革素B、伊枯草菌素四种已知脂肽类化合物和一种未知的脂肽类化合物。通过双皿对峙实验,发现该菌株产生的挥发性有机物能抑制多种病原真菌的生长。经菌株BEB17产生的挥发性有机物熏蒸处理后,Foc4菌丝发生缢缩膨大,细胞膜破裂,孢子萌发被抑制。采用顶空法固相微萃取结合气质联用(HS-SPME-GC-MS)对该菌株产生的挥发性有机物(VOCs)进行收集鉴定,得到32种单体有机物组分。依据化合物不同性质大致可分为烯烃类(9种),烷烃类(6种),酮类(2种),醇类(2种),酚类(2种),酯类(5种),胺类化合物(2种),杂环化合物(1种),卤代烃类(2种)和苯并噻唑类化合物(1种)。利用稀释平板涂布法,观察菌株BEB17在不同品种香蕉植株的定植情况,发现BEB17均能稳定定植于四个香蕉品种,其中在南天黄的根部定植10d后定植量最高,达6.43 X 104 CFU/g,在桂蕉1号定植10 d和20 d后球茎和叶部定植量达峰值,分别为1.58X 103 CFU/g和1.43X 103 CFU/g,定植数量均呈先升后降趋势;品种比对发现菌株BEB17与南天黄和桂蕉1号的亲和性较强。采用直接灌根法,评价了该菌株对四个不同香蕉品种的促生作用和其对香蕉枯萎病的防治效果。结果表明,回接BEB17后,香蕉杯苗的平均株高、叶片数和鲜重均显著优于对照,其中该菌株对南天黄的促生效果最好,株高增加48.24%,鲜重增加111.19%;带菌植株接种Foc4后,香蕉杯苗在发病率和病情指数上均显著低于对照,其中该菌株对南天黄和桂蕉1号的防治效果最明显,相对防效可达81.51%和77.46%。
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