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NAD激酶(NADK)是生物体内普遍存在的唯一催化NAD(H)磷酸化生成NADP(H)的关键酶,在调节细胞内NADP(H)代谢依赖的NAD(H)/NADP(H)的平衡方面起重要作用。NAD(H)和NADP(H)是生物体内细胞代谢过程中多种酶的辅酶,参与多个氧化还原反应,影响细胞氧化代谢的速率和途径。然而,目前人们对植物NADK家族基因的功能及其表达调控机制研究较少,对水稻、小麦等大作物NADK家族基因的功能与抗性的关系及其转录调控机制等,仍不明确。本研究首先运用生物信息学的方法,从全基因组水平分析了植物NADK家族基因的系统发育和进化机制,明确了其逆境表达特点,然后利用一系列分子生物学、细胞生物学和植物生理学等的方法,对水稻和小麦NADK家族基因尤其是OsNADK1和TaNADK4的功能进行了深入研究,取得的主要研究结果如下:1.运用生物信息学的方法,对来自植物界8个代表谱系24个物种的74个NADK家族基因进行系统发育分析,表明植物基因组中包含4个保守的NADK亚家族,各亚家族具有特定的功能域及保守的基因结构。典型的NAD_kinase结构域是所有NADK蛋白都具备的,亚家族Ⅱ还含有ADK或PTPc或PTPc/DSPc结构域,而亚家族Ⅲ的NAD_kinase结构域被分为两部分,且与其他亚家族序列的相似性较低(~30%),揭示了在进化过程中,基因复制后可能发生了基因融合和外显子重排,分别导致亚家族Ⅱ和Ⅲ中结构域的变化。基因结构分析表明单个内含子的丢失或获得导致亚家族间基因结构的多样化。芯片数据分析及qRT-PCR实验表明,水稻OsNADKs和拟南芥AtNADKs基因有不同的组织特异性及诱导表达模式,表明植物NADK基因功能的多样性。2.克隆了水稻OsNADK1基因并对其抗逆分子机制进行了研究,发现OsNADK1定位于水稻细胞质,在水稻各个发育阶段各个组织中均有表达且其表达受环境胁迫影响。与野生型相比,其T-DNA插入突变体osnadk1,表现出植株矮小、黄化等特点,其胞内NADPH/NADP~+、ASA/DHA、GSH/GSSG的比值降低。此外,osnadk1中许多胁迫相关基因的表达模式在正常生长和干旱胁迫下发生了改变,特别是3个转录因子基因OsDREB1B、OsWRKY21和OsWRKY42,无论在突变体osnadk1还是在OsNADK1过表达或沉默表达的转基因植株中,均与OsNADK1表现出显著的共表达关系,显示这三个转录因子在OsNADK1抗逆调控中具有重要作用。此外,过表达OsNADK1可以积累脯氨酸,提高干旱下水稻植株的抗性,而osnadk1和RNAi植株则相反,抗性较弱。这些研究结果表明,OsNADK1可能通过调控细胞内氧化还原平衡而参与水稻抗旱性形成。3.鉴定了禾谷类作物3个亚科11个物种的44个NADK基因。系统发育及基因结构分析表明,禾本科NADK可分为3个亚家族,多数物种含4个NADK同源基因。基于小麦EST数据分析(由于小麦基因组尚未完成基因注释),预测了11个小麦NADK同源基因,克隆了其中4个小麦NADK基因,即TaNADK1~4,亚细胞定位分析发现:TaNADK1和TaNADK2定位于细胞质,TaNADK3定位在叶绿体,TaNADK4在过氧化物酶体;对这4个小麦NADK基因的组织表达与诱导表达进行分析,结果显示其表达具有明显的组织特异性与胁迫表达差异性。4.克隆了小麦TaNADK4在染色体5B上的启动子,通过酵母单杂交的方法筛选小麦cDNA文库,获得了两个具有自激活活性且同为HDzipI亚家族的转录因子TaHOX1和TaHDZipI-1。转录激活实验说明这两个转录因子与TaNADK4-5B的启动子在植物体内可以结合;TaNADK4还可以被PTS1转运蛋白TaPEX5识别,转运至过氧化物酶体,且其自身可以形成同源二聚体或多聚体。同时,筛选到拟南芥中与小麦TaNADK4同源的基因AtNADK3的纯合突变体atnadk3;构建过表达载体,转化农杆菌,侵染水稻愈伤组织和拟南芥未授粉的花,获得过表达和基因互补的转基因株系,对自交后的转基因植株进行GUS染色、DNA、RNA及蛋白水平的验证,为进一步深入研究TaNADK4的功能及分子机制打下基础。总之,植物NADK家族基因在结构和功能上具有广泛的多样性,基因融合和外显子重排是该家族基因进化的主要方式。胞质定位的水稻OsNADK1响应多种环境因子,可能通过调控细胞内氧化还原平衡而参与植株抗旱性的形成。过氧化物酶体定位的小麦TaNADK4同样对环境胁迫响应,其在TaPEX5的协助下转运至过氧化物酶体,基因表达可能受两个转录因子TaHOX1和TaHDZipI-1的调控。