rhTNFR:Fc对糖尿病肾病大鼠肾脏组织中RIP1和RIP3表达的影响

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目的:探讨rh TNFR:Fc是否能够通过抑制坏死性凋亡途径的激活,从而减轻糖尿病肾病大鼠肾脏组织损伤和炎症介质的释放。方法:100只成年雄性Sprague Dawley(SD)大鼠,标准化喂养3天后将SD大鼠按随机原则分为正常对照组(N组)、正常+rh TNFR:Fc组(NY组),每组18只,剩下的64只SD大鼠用于造模,采用一次性腹腔注射链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ),50mg/kg,最终成模56只,未成模5只,死亡3只(死于撕咬),在成模的56只大鼠中随机选取54只进行实验,分为DN组、DN+灭菌注射用水组(K组)、DN+rh TNFR:Fc组(Y组),上述每组18只,设4周、8周、12周末为观察点。将rh TNFR:Fc溶解于灭菌注射用水后按单次剂量4mg/kg,从造模成功后第1天开始皮下注射,隔天1次,直至12周末。每个时间节点每组随机选取6只大鼠处死,分别检测24小时尿蛋白、血糖、血清尿素和肌酐。将肾组织进行苏木素-伊(Hematoxylin-eosin,HE)和过碘酸-雪夫染色(Periodic Acid-Schiff,PAS)观察肾脏组织形态。同时采用免疫组化染色观察和检测肾脏组织中受体相互作用蛋白1(Receptor interaction protein 1,RIP1)、受体相互作用蛋白3(Receptor interaction protein3,RIP3)、白介素-6(Interleukin-6)和肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor,TNF-α)的分布及表达情况。采用蛋白印迹(Western-blot,WB)和实时荧光定量聚合酶链反应(Real-Time PCR,RT-PCR)方法检测肾组织中RIP1、RIP3、TNF-α和IL-6的m RNA和蛋白表达量。最后,分析rh TNFR:Fc对糖尿病肾病大鼠以上指标的影响。结果:1.血糖:DN组、K组血糖水平高于N、NY组,且随时间逐渐增加(P<0.01或P<0.05),Y组不同时间点均明显低于DN、K组(P<0.01)。2.24小时尿蛋白:DN、K组24小时尿蛋白水平高于N、NY组(P<0.01或P<0.05)。3.血清肌酐:在不同时间点DN、K组血清肌酐高于N、NY组(P<0.01),Y组不同程度低于DN、K组(P<0.01)4.血清尿素:不同时间点DN、K组血清尿素水平均高于N、NY组(P<0.01),而Y组不同程度低于DN、K组(P<0.01)。5.肾组织HE、PAS染色:DN组、K组可见肾小球内细胞数增多,DN、K组肾小球内细胞数增多,部分肾小管萎缩,系膜基质不同程度增多;Y组大鼠的上述肾脏病理改变较DN、K组均减轻。6.免疫组化:通过免疫组化染色可见RIP1、RIP3、IL-6和TNF-α主要表达于肾小球;定量检测发现,在不同时间点DN、K组以上指标的表达量均高于N、NY组(P<0.01),而Y组以上指标表达量均较DN、K组减少(P<0.01或P<0.05)。7.WB:比较不同时间点DN、K组与N、NY组肾组织中RIP1、RIP3、IL-6和TNF-α蛋白相对表达量,可见DN、K组均高于N、NY组(P<0.01),而Y组以上指标的蛋白表达量均较DN、K组明显减少(P<0.05)。8.RT-PCR:在DN大鼠肾脏组织检测到编码中RIP1、RIP3、IL-6和TNF-α的m RNA,并且以上指标的相对表达量高于N、NY组(P<0.01),而Y组以上指标的m RNA相对表达量较DN、K组减少(P<0.01)。在不同时间点分别比较N与NY组和DN与K组的血糖、尿蛋白、血清尿素、血清肌酐、蛋白和m RNA相对表达均无显著性差异(P>0.05)。结论:使用rh TNFR:Fc干预后,DN大鼠肾组织中RIP1、RIP3、IL-6和TNF-α表达均下降,rh TNFR:Fc可能通过抑制TNF-α与其受体结合,减少了坏死性凋亡途径的激活,进而减轻肾脏组织的损伤和炎症介质的释放。
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