论文部分内容阅读
以GTP与核黄素合成代谢去调控的突变型原核微生物作为受体菌,构建过量合成核黄素的基因工程菌,用于核黄素的工业发酵,是核黄素工业产生的新技术.增加核黄素操纵子在细胞中的基因剂量,提高其编码酶的表达水平,是构建核黄素发酵基因工程菌的基本手段.该文以质粒pMX45为模板,PCR扩增了枯草芽孢杆菌4.6Kb的rib操纵子.该片断分别与E.coli-B.subtilis穿梭载体pBE2和pHP13连接,构建了重组质粒pBE2R和pHP13R;与穿梭载体pDG364和pDG1664连接,构建了重组质粒pDG364R和pDG1664R.重组质粒分别转化DH5α,进行了扩增和酶切鉴定.以枯草芽孢杆菌DB104染色体为模板,PCR扩增了1.5Kb的recA片断,与pBE2连接得到重组质粒pBE2-REC,转化B.subtilis24筛选出recA<+>的转化子B.subtilis 24R,其核黄素合成能力为1100mg/l.同时筛选B.subtilis 24与B.subtilisDB104的原生质体融合子,得到recA<+>的融合子B.subtilis RH,能够积累440mg/l的核黄素.重组质粒pBE2R、pHP13R、pDG364R和pDG1664R分别转化B.subtilis 24R和RH,除pBE2R得不到稳定的转化子外,其余转化得到了一系列转化子.核黄素发酵结果表明:在选择压力下,B.subtilis 24R/pHP13R能够积累2000mg/l核黄素;RH/pHP13R能够积累1800mg/l的核黄素;但是没有选择压力,连续传递30代,其质粒丢失率分别为65﹪和36﹪.整合型重组质粒pDG364R在amyE位点,以双交换方式整合形成的重组菌B.subtilis 24R[rib-cat]和B.subtilis RH[rib-cat],核黄素合成能力提高最显著,分别达到1700mg/l和1140mg/l.用Cm对染色体上整合的rib-cat片断扩增,得到的B.subtilis RH[rib-cat]<,50>,核黄素积累浓度达到3000mg/l;B.subtilis 24R[rib-cat]对Cm的扩增效果不显著,B.subtilis 24R[rib-cat]<,30>核黄素积累浓度为2200mg/l.pMX45转化得到的转化子B.subtilis 24R[rib-cat]<,30>/pMX45与B.subtilis RH[rib-cat]<,40>/pMX45,核黄素合成能力没有明显提高.但两者进行原生质体融合,筛选出的一株融合子B.subtilisRH33/pMX45,其摇瓶发酵核黄素的积累浓度达到4200mg/l,与B.subtilis RH[rib-cat]<,50>相比,提高33﹪.