QCM细胞芯片的研制及其在癌细胞表面糖基化研究中的应用

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基于石英晶体微天平(QCM)技术的生物传感器可以实时、无标记地检测生物分子的相互作用,获得亲和力和动力学等丰富的相互作用信息,为深入研究生物分子相互作用过程,进一步研究相互作用机理提供了一种强有力的检测手段,在科学研究、药物研发和疾病诊断等领域得到了广泛的应用。然而,在分子相互作用研究中,要想全面的分析生物分子的相互作用,仅依靠亲和力和动力学参数是远远不够的。生物分子结合和解离过程中的热力学参数(如熵变、焓变、吉布斯自由能以及活化能等)在生物分子识别的机理研究中起着非常重要的作用。目前利用生物传感器技术进行生物分子相互作用的热力学研究的研究对象均为纯化的生物分子,仍没有关于在细胞表面进行生物分子相互作用的热力学研究的报道。另外,在制备QCM细胞芯片时,对于贴壁细胞,通常利用其贴壁生长的特性使细胞粘附到芯片表面。但对于悬浮细胞,由于其悬浮生长的特性,将其固定到芯片表面困难较大。针对这两个问题,本论文进行了以下两方面的研究:一、本研究建立了一种利用QCM生物传感器研究蛋白与非固定癌细胞表面糖基相互作用的动力学和热力学的新方法。该方法所测相互作用直接发生在细胞表面,更加接近生物相关环境。在本研究中,人结肠癌细胞(KM-12)和人卵巢癌细胞(SKOV-3)直接生长在芯片表面,且无需固定。所制备的芯片具有较好的稳定性、特异性和重复性。通过实时、无标记检测一系列凝集素与细胞表面糖基的相互作用对细胞表面的糖基化情况进行评估。通过检测不同温度下凝集素与细胞表面糖基的相互作用的亲和常数、结合速率常数和解离速率常数,然后通过van’t Hoff方程和Eyring方程拟合,获得相互作用的熵变、焓变、吉布斯自由能变化以及过渡态信息等丰富的热力学参数。与传统的等温滴定量热法(ITC)相比,该方法具有样品消耗量少、检测灵敏度高,可同时获得相互作用的动力学和热力学全套数据等特点,且该方法只检测分子之间的结合和解离,排除了溶质稀释、溶液混合等其它热效应的影响。该研究使我们能够更加深入地了解癌细胞表面糖基化情况,为全面分析细胞表面复杂的分子相互作用的动力学和热力学信息提供了一种新方法,在疾病诊断和药物研发中具有重要意义。二、本研究制备了一种新型的、基于QCM生物传感器技术的聚多巴胺(PDA)悬浮细胞芯片,用于悬浮癌细胞表面糖基化及其与凝集素相互作用的动力学研究。该芯片制备方法简单、反应条件温和,且可重复使用。只需简单的将QCM裸金芯片浸入到pH8.5的多巴胺溶液中一段时间便可在芯片表面包被一层PDA薄膜。通过条件优化,我们首次成功地将悬浮细胞直接固定到PDA表面,制备PDA悬浮细胞芯片。利用所制备的PDA悬浮细胞芯片,我们对人急性单核细胞白血病细胞(THP-1)、人急性T淋巴细胞白血病细胞(Jurkat)和人慢性骨髓性白血病细胞(K562)三种不同类型的人白血病细胞表面的糖基化情况,以及凝集素Con A与THP-1细胞的相互作用的动力学进行了研究。本研究为悬浮细胞的固定提供了一个新方法,为研究悬浮肿瘤细胞表面糖基化情况及其表面复杂的分子相互作用提供了一种新手段。另外,该芯片不仅制备方法简单,而且经过简单的清洗便可使其恢复至裸金芯片,使得芯片可重复使用,大大提高了QCM生物传感器实验的效率、降低了实验成本,对QCM生物传感器的发展及生物分子相互作用研究具有重要意义。
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