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Ⅲ型分泌系统(TTSS)存在许多植物和动物的革兰氏阴性病原体中,使宿主菌或非宿主菌产生伤害或者过敏反应。调查结果显示,Ⅲ型分泌系统2(TTSS)存在与不同致病性大肠杆菌中,可能以突变形式插入到宿主菌中。禽致病性大肠杆菌(Avian pathogenic Escherichia coli,APEC)能够引起致病性大肠杆菌病,给养禽业带来不可低估的经济损失。为研究大肠杆菌Ⅲ型分泌系统2(E.coli.type three secretion system 2,ETT2)部分基因位点的相关功能以及抗原相关性,本文对yqeH、yqeJ、yqeK基因进行敲除,并通过免疫血清进行分析,为进一步研究ETT2致病性提供参考依据。ETT2的3个编码基因yqeH、yqeJ、yqeK与沙门菌SPI-3的相关基因具有一定的同源性,分别位于ECs3703、ECs3705、ECs3706。为分别构建禽大肠杆菌3株ETT2的yqeH、yqeJ、yqeK基因的缺失株,根据已发表的Ecs3703、ECs3705、ECs3706基因序列设计特异性敲除引物,利用Red同源重组技术分别对禽大肠杆菌A130512株的ECs3703、ECs3705、ECs3706进行基因置换。获得的重组菌进一步利用FLPe质粒在30℃条件下可以表达、温度升高时丢失的特性,将FRT同源臂所携带的氨苄抗性基因以及FLPe质粒携带的氯霉素抗性基因进行消除;最后通过PCR及序列测定,筛选到不含有抗性基因的缺失株,并分别命名为 A130512△ECs3703、A130512△ECs3705、A130512△ECs3706。为进一步研究yqeH、yqeJ、yqeK基因编码蛋白的特性,分别设计出3对引物;利用PCR分别扩增yqeH、yqeJ、yqeK基因的抗原表位富集区序列,并克隆至pET-30a表达载体中。通过PCR和酶切分析,分别获得含有相应基因的重组质粒。将获得的重组质粒转化至BL21(DE3),并进行IPTG诱导表达。经过SDS-PAGE以及Western-blot分析后,3个融合蛋白大小位置分别为29 kD、19 kD、21 kD。获得的3个融合蛋白分别命名为 His-YqeH、His-YqeJ、His-YqeK。为检测His-YqeH、His-YqeJ、His-YqeK3个融合蛋白的抗原性,分别将表达产物进行SDS-PAGE,切取含有目的条带的蛋白并免疫健康獭兔。第3次免疫后第7天采集并分离血清;以制备的血清作为一抗,辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG作为二抗,对His-YqeH、His-YqeJ、His-YqeK3个蛋白抗原进行Western-blot分析;结果显示多抗血清均能与重组蛋白发生反应。通过与原始细菌A130512以及3株缺失株的裂解上清液和沉淀的Western-blot分析,DyLight 800标记羊抗兔IgG作为二抗。结果显示:3个His-YqeH、His-YqeJ、His-YqeK多抗血清与A130512株细菌裂解上清以及3株缺失株A130512△ECs3703、A130512△ECs3705、A130512△ECs3706 细菌裂解上清不发生反应,与A130512全菌裂解物发生反应;His-YqeH多抗血清与A130512株细菌裂解沉淀以及A130512△ECs3705、A130512△ECs3706 细菌裂解沉淀发生反应,与 A130512△ECs3703细菌裂解沉淀不发生反应;His-YqeJ多抗血清与A130512株细菌裂解沉淀以及A130512△ECs3703、A130512△ECs3706 细菌裂解沉淀发生反应,与 A130512△ECs3705细菌裂解沉淀不发生反应;His-YqeK多抗血清与A130512株细菌沉淀以及A130512△ECs3703、A130512△ECs3705 细菌裂解沉淀发生反应,与 A130512△ECs3706细菌裂解沉淀不发生反应。