论文部分内容阅读
目的:制备柔性纳米脂质体载野黄芩苷(S-FNL),并研究比较柔性纳米脂质体载野黄芩苷(S-FNL)和野黄芩苷(S)的体外促成骨作用。方法:1.S-FNL的制备及方案优化:采用薄膜水化法,将水浴锅、旋转蒸发仪设置不同的温度、转速,以大豆卵磷脂、胆固醇为原料,制备空白纳米脂质体(NL)。采用马尔文激光粒度分析仪测量脂质体粒径、多分散系数(PDI),采用透射电镜TEM观察脂质体形态,以期优化脂质体的制备温度及转速。采用薄膜水化法,按照优化所得最佳制备温度及转速,以大豆卵磷脂、胆固醇、硬脂酰胺、胆酸钠、野黄芩苷为原料,制备S-FNL,通过单因素实验、正交实验,比较分析S-FNL药物包封率,优化S-FNL的制备方案。采用马尔文激光粒度分析仪测量脂质体的粒径、PDI、Zeta电位,采用TEM观察脂质体形态。2.原代成骨细胞的培养、鉴定:采用酶消化联合组织块法提取新生SD大鼠颅骨成骨细胞,配合差速贴壁法纯化,培养至第3代,根据细胞形态观察、生长曲线绘制、碱性磷酸酶(ALP)染色、钙结节染色(茜素红染色法)进行成骨细胞鉴定。3.体外促成骨作用的研究:通过细胞增殖实验(CCK-8实验)测量并比较不同药物浓度作用下的细胞相对OD值,筛选最佳药物浓度。按照给药的不同,设置实验分组为S-FNL组(柔性纳米脂质体载野黄芩苷组)、S组(单纯野黄芩苷组)、BC组(空白对照组)。根据分组,以最佳药物浓度进行CCK-8实验、ALP活力检测,测量OD值,计算各组细胞生存率、ALP活力。采用GraphPad Prism 8.0.2软件进行统计分析,P<0.05为有统计学差异。茜素红染色法对各组细胞进行钙结节染色,在显微镜下观察比较三组钙结节的生成情况。结果:1.采用薄膜水化法成功制备NL,优化所得最佳制备方案为:旋蒸温度40℃,转速66 r/min;水化温度48℃,转速88 r/min。所得NL平均粒径(70.5±5.39)nm,PDI(0.191±0.01);TEM下可见NL形态为类球形。制备S-FNL最佳比例为卵磷脂和胆固醇的质量比2:1,卵磷脂和野黄芩苷的质量比20:1,卵磷脂和硬脂酰胺的质量比8:1,卵磷脂和胆酸钠的质量比8:1,水化体积(即PBS缓冲液)1 mL。所得S-FNL平均粒径(153.2±3.35)nm,PDI(0.188±0.02),Zeta电位(-32.1±1.57)mV,包封率(47.2±0.30)%;TEM下可见S-FNL形态为类球形。2.提取的原代大鼠成骨细胞贴壁后表现出不同的形态,如三角形、梭形、多边形等。成骨细胞之间通过突起连接,接触式、漩涡式生长。成骨细胞在接种后3～5天内增长迅速,处于对数生长期;第5天最高,以后增长缓慢,进入平台期。经ALP染色后镜下可见呈深蓝色或蓝紫色的ALP活性部位。经茜素红染色后镜下可见被染成橙红色的钙结节。3.CCK-8实验筛选最佳药物浓度为15μg/mL。与BC组相比,S-FNL组、S组均能更好的促进细胞增殖、ALP表达(P<0.05),且S-FNL组的促进作用优于S组(P<0.05)。三组细胞经茜素红染色后,均能在镜下看到被染成橙红色的钙结节,镜下比较:S-FNL组>S组>BC组。结论:本实验采用薄膜水化法成功制备S-FNL,且优化了制备方案。通过体外实验证实S-FNL比单纯S对成骨细胞有更好的促成骨作用,但是S-FNL的具体促成骨机制以及其在体内的促成骨效果,仍然需要进一步的探索、研究。