芳香化酶由CYP19A1基因编码,是促使雄激素转化为雌激素的关键限速酶。雌激素最早被认为是女性性激素,近些年被证明在雄性生理及繁殖中有着重要的作用,目前芳香化酶和雌激素对鸡精液品质和繁殖性能方面的研究尚未深入开展。鸡芳香化酶的表达调控机制与哺乳动物不同,本研究首先聚焦于芳香化酶的转录调控,拟解决CYP19A1表达受哪些转录因子调控,为后续定点调控CYP19A1表达提供理论基础;在此基础上在鸡睾丸中过表达和抑制芳香化酶,从转录水平、蛋白水平、代谢水平和胞外囊泡层面揭示其对鸡繁殖性状的影响,为提高精液品质、延长公鸡种用时间寻找辅助标记。主要研究结果如下:1.使用序列比对方法分析芳香化酶的物种间保守性,同源建模法模拟出鸡芳香化酶蛋白三级结构,发现鸡芳香化酶三维结构和人芳香化酶结构相似度高,芳香化酶进化极其保守。免疫荧光法和免疫组化检测到CYP19A1、ESR1、ESR2和NR5A2均在鸡卵泡膜细胞层中表达。培养鸡卵泡膜细胞和传代细胞,为探索鸡芳香化酶转录调控机制提供合适的细胞模型。采用荧光定量PCR检测卵泡膜细胞中CYP19A1、ESR1、ESR2和NR5A2等基因m RNA表达水平,发现CYP19A1和NR5A2的表达量随着时间推移急剧下降,ESR2的表达量增加,ESR1的表达量无显著变化。2.采用双荧光素酶报告系统对CYP19A1启动子活性进行分析,发现-368 bp到-9 bp显示完整的启动子活性。ESR1增强CYP19A1启动子截短片段P3的活性（从-368 bp至-9 bp）,并抑制片段P2的活性（从-511 bp至-9 bp）。NR5A2增强CYP19A1启动子截短片段P3的活性（从-368 bp至-9 bp）并抑制片段P4的活性（从-197 bp至-9 bp）。Western blotting研究表明ESR1、ESR2和NR5A2的过表达能上调CYP19A1的蛋白表达,且ESR1、ESR2和NR5A2形成了一个网络模块,该网络模块中各节点通过相互约束调节CYP19A1的表达。3.构建慢病毒过表达CYP19A1载体,使用不同浓度的慢病毒过表达CYP19A1载体定点注射公鸡睾丸,q PCR和Western blotting实验证明过表达CYP19A1的睾丸模型建立成功。免疫荧光实验定位CYP19A1在对照组和低浓度慢病毒注射组睾丸间质细胞中大量表达,在高浓度慢病毒注射组睾丸的支持细胞中表达量增加。通过研究公鸡睾丸曲细精管形态变化、鉴定精液品质和受精力、检测精液和血清的激素含量,证实睾丸高浓度过表达CYP19A1导致公鸡雌激素含量升高,睾酮含量降低,睾丸曲细精管直径增大,上皮厚度减小,最终导致精液品质下降。4.高浓度过表达CYP19A1的公鸡睾丸转录组和蛋白组测序分析结果显示,CYP19A1通过调控性激素合成通路、WNT信号通路、免疫反应等多个生物学过程,改变HSD3B1、PLTP、WNT5A、SLC9A3R1等基因和蛋白的表达量,使公鸡睾丸器官形态学异常,支持细胞骨架受损,精子尾部鞭毛鞭打频率降低、活力降低。研究结果表明公鸡受精力高低和精子活力有着复杂且协调的生物学过程,证实CYP19A1在公鸡生殖器官发育、精液品质、受精力、性激素合成中起重要的作用。5.分离各处理组鸡精浆胞外囊泡,对照组、低浓度慢病毒注射组、高浓度慢病毒注射组精浆的胞外囊泡的物理形态和粒径大小未发生显著变化,但囊泡内部分蛋白表达量发生显著的变化。蛋白组测序结果显示低浓度慢病毒CYP19A1注射组公鸡精浆胞外囊泡差异蛋白大多被富集到能量代谢通路,高浓度慢病毒CYP19A1注射组公鸡精浆胞外囊泡差异蛋白大多被富集到免疫疾病通路。Western blotting验证实验结果提示SOD3和CAV1或可成为判定公鸡受精力的辅助标记。6.使用芳香化酶抑制剂Letrozole处理低受精力的公鸡,发现抑制芳香化酶活性能提高精子活力,改善精液品质。精液代谢组结果显示芳香化酶会影响牛磺酸、类固醇激素合成、甘油磷脂和胆固醇等代谢通路,使公鸡精液中精氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸等多种必需氨基酸含量增加,牛磺酸、牛磺胆酸及甘氨鹅脱氧胆酸代谢物含量增加,合成雌激素和睾酮的前体物质含量下降,进而影响公鸡繁殖性状。综合以上结果揭示鸡CYP19A1在性腺中的转录调控与哺乳动物不同,ESR1、ESR2和NR5A2通过相互约束调节CYP19A1的表达,芳香化酶通过影响鸡类固醇激素合成通路、牛磺酸代谢通路、WNT信号通路及精浆胞外囊泡的蛋白组成,改变激素分泌、睾丸表型和精子活力,对鸡精液品质和受精力具有至关重要的作用。