论文部分内容阅读
分娩是炎症和激素变化的过程,涉及子宫肌层和来自胎盘、胎膜和胎儿信号之间的相互作用。清平猪是湖北省的优良地方品种,具有妊娠期短的特性,但其提前分娩的机理还不清楚。miRNAs可以通过调控子宫肌层中转录因子、子宫收缩相关基因和激素合成与代谢相关酶的表达参与到妊娠的维持和分娩启动过程。课题组前期miRNA测序结果发现,miR-132-3p在有分娩征兆大白猪和清平猪胎盘组织中上调表达。研究表明miR-132-3p能通过抵抗或触发炎症反应参与多种免疫相关疾病的发生发展进程。胎膜是最初接受胎儿成熟信号的部位,但miR-132-3p在胎膜中如何参与分娩启动尚不清楚。因此,本研究拟利用正常妊娠模型和脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导小鼠早产模型,分析在足月分娩和感染诱导早产中miR-132-3p的表达模式;运用在线生物信息学网站预测miR-132-3p的靶基因,利用人羊膜上皮细胞(WISH)探究miR-132-3p对细胞炎症反应和激素级联的作用;在活体水平上注射miR-132-3p agomir验证其对分娩的影响,同时检测在不同妊娠阶段的清平猪和大白猪羊膜、绒毛膜和胎盘中miR-132-3p、其靶基因及相关信号通路的表达,最终来阐明miR-132-3p在清平猪中介导提前分娩的分子机制。主要研究结果如下:1.正常妊娠模型和LPS诱导小鼠早产模型中miR-132-3p、分娩相关基因和信通路的表达情况RT-qPCR和Western blot检测结果表明:与妊娠15.5 d小鼠相比,妊娠18.5d小鼠羊膜组织中miR-132-3p、白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、白介素6(interleukin-6,IL-6)、白介素8(interleukin-8,IL-8)、环氧合酶2(cyclooxygenase2,COX2)、趋化因子CC基序配体5(chemokine C-C motif ligand 5,CCL5)和趋化因子C-X-C基序配体16(chemokine CXC motif ligand 16,CXCL16)表达量均显著上调(P<0.05),p38和JNK磷酸化蛋白水平显著升高(P<0.01)。皮尔逊相关性分析表明miR-132-3p与IL-1β、IL-6、COX2、CCL5和CXCL16 mRNA呈显著正相关(P<0.05),而与IL-8 mRNA无显著相关性(P>0.05)。早产模型羊膜组织中miR-132-3p、IL-1β、IL-6、COX2、CCL5和CXCL16表达量、p38和JNK磷酸化蛋白水平显著高于对照组(P<0.05)。表明miR-132-3p可能参与分娩的发生。2.miR-132-3p促进羊膜上皮细胞中炎症和激素级联反应RT-qPCR、Western blot、液相多因子检测和ELISA分析表明:与对照组相比,miR-132-3p显著上调WISH细胞中炎症因子(IL-1β、IL-6、TNF-α)、COX2、CC趋化因子(CCL5、CCL20、CCL22、CCL28)和CXC趋化因子(IL-8、CXCL10、CXCL11、CXCL16)的表达以及前列腺素E2(Prostaglandin E2,PGE2)的分泌(P<0.05)。表明miR-132-3p促进了羊膜上皮细胞中炎症和激素级联反应。3.DUSP9是miR-132-3p的靶基因在线生物信息学网站预测了miR-132-3p的潜在靶基因为DUSP9,双荧光素酶报告基因系统验证了miR-132-3p可以靶向其3’非翻译区(3’untranslated region,3’UTR)。WISH细胞中过表达或抑制表达miR-132-3p能显著抑制或促进DUSP9mRNA和蛋白的表达(P<0.05)。免疫组化分析表明DUSP9蛋白在小鼠羊膜上皮细胞表达。与妊娠15.5 d小鼠相比,在妊娠18.5 d小鼠羊膜组织中DUSP9mRNA和蛋白表达水平显著降低(P<0.05);但在早产模型的羊膜组织中DUSP9mRNA和蛋白表达水平与对照组相比无显著差异(P>0.05)。表明miR-132-3p靶向DUSP9且负调控其表达,DUSP9可能不参与感染诱导早产的发生。4.miR-132-3p靶向DUSP9激活p38和JNK信号通路增强羊膜中炎症反应和PGE2合成RT-qPCR、Western blot、液相多因子检测和ELISA分析表明,与对照组相比,在WISH细胞中抑制表达DUSP9后,显著促进了炎症因子、CC趋化因子、CXC趋化因子、COX2的表达以及PGE2的分泌(P<0.05),抵消了miR-132-3p inhibitor的抑制作用。表明miR-132-3p通过靶向DUSP9调控炎症水平和PGE2的分泌。Western blot分析表明:与对照组相比,WISH细胞中转染miR-132-3p mimic和DUSP9 si RNA后,p65、p38和JNK磷酸化蛋白水平均显著升高(P<0.05),而抑制表达miR-132-3p后磷酸化水平显著降低(P<0.05)。干扰DUSP9后添加p38抑制剂(Adezmapimod,SB203580)和JNK抑制剂SP600125,显著降低了炎症水平和PGE2的分泌(P<0.05),而添加NF-κB抑制剂PDTC(Pyrrolidinedithiocarbamate ammonium,PDTC)无显著差异(P>0.05)。表明miR-132-3p靶向DUSP9对炎症反应和PGE2合成的调控依赖于p38和JNK信号通路,而不是NF-κB信号通路。5.孕鼠腹腔注射miR-132-3p agomir对分娩启动的影响分别对妊娠15.5 d小鼠腹腔注射agomir NC和miR-132-3p agomir,注射miR-132-3p agomir组相比agomir NC组明显缩短了小鼠妊娠时间(P<0.01),未造成母体和胎儿死亡。RT-qPCR和Western blot分析表明:与agomir NC组相比,注射miR-132-3p agomir组小鼠羊膜中COX2 mRNA和蛋白表达水平、p38和JNK磷酸化蛋白水平均极显著上调(P<0.01),DUSP9蛋白表达水平显著下调(P<0.05)。表明在体内miR-132-3p通过抑制DUSP9的表达激活p38和JNK信号通路,进而促进COX2的表达来启动分娩。6.妊娠末期妊娠期为111 d的清平猪羊膜、绒毛膜和胎盘中炎症和激素级联反应早于妊娠期为114 d的清平猪和大白猪RT-qPCR和Western blot检测结果表明:miR-132-3p在妊娠109 d无分娩征兆清平猪(PRE109Q)羊膜组织中表达水平高于妊娠112 d无分娩征兆大白猪(PRE112D)和妊娠111 d无分娩征兆清平猪(PRE111Q)(P<0.01)。在妊娠状态下,PRE109Q羊膜和绒毛膜组织中p38磷酸化蛋白水平(P<0.05)、胎盘组织中IL-6、CCL5(P>0.05)和CXCL16(P<0.05)表达量高于PRE112D和PRE111Q,但DUSP9蛋白表达水平无显著差异(P>0.05);在分娩状态下,妊娠111 d有分娩征兆清平猪(PAR111Q)羊膜组织中COX2蛋白表达水平高于妊娠114 d有分娩征兆大白猪(PAR114D)和妊娠114 d有分娩征兆清平猪(PAR114Q)(P<0.05),但羊膜中DUSP9蛋白表达无显著差异(P>0.05)。以上结果表明miR-132-3p在妊娠期为111 d的清平猪中通过提前激活炎症和激素级联反应促进提前分娩。综上所述,(1)miR-132-3p通过靶向DUSP9激活p38和JNK信号通路进而促进羊膜中炎症反应和PGE2的合成,导致分娩的发生。(2)miR-132-3p在妊娠末期短妊娠期清平猪中通过提前激活炎症和激素级联反应促进提前分娩。